Культура клітинних суспензій

Культура клітинних суспензій або суспензійна культура – вирощування окремих або невеликих агрегатів у завислому (суспендованому) стані в рідкому середовищі при використанні апаратури, яка забезпечує їх аерацію і перемішування.

Суспензійна культура використовується для вивчення фізіологічних закономірностей росту, диференціації, метаболізму соматичних клітин вищих рослин. Особливе значення має використання біосинтетичного потенціалу рослинних клітин для промислового отримання при великомасштабному культивуванні ряду економічно цінних речовин – алкалоїдів, стероїдних сполук, глюкозидів, ефірних олій, ферментів тощо.

Клітинну суспензію отримують з шматочка калюсу в рідкому середовищі, яке перемішується. Для ініціації суспензійної культури необхідно 2-3 г свіжої калюсної маси на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Первинну суспензію отримують на коловому шейкері зі швидкістю перемішування 100-120 об/хв.

Суспензійну культуру можна отримати також із фрагмента органа рослини (листок, стебло, корінь). Спочатку на поверхні експлантата утворюється первинний калюс, а потім від нього відділяються клітини і клітинні агрегати, які дають початок клітинній суспензії.

Для отримання високо диспергованої суспензійної культури велике значення має тип вихідної калюсної тканини. Оптимальною є калюсна тканина пухкого типу, яка легко розсипається при внесенні в рідке середовище, що перемішується. Для цього калюс вирощують на середовищі з високою концентрацією ауксинів і зменшеною концентрацією або без цитокінінів і без іонів Са²⁺. Додавання в середовище фермента пектинази, який руйнує пектат кальцію, що склеює окремі клітини, полегшує отримання суспензії.

Необхідною умовою культивування клітинних суспензій є постійне перемішування середовища. Якщо клітинна суспензія перебуває в нерухомому стані, то ділення суспензійних клітин призводить до утворення калюсної тканини.

Первинну суспензійну культуру перед субкультивуванням фільтрують через 1-2 шари марлі, нейлонові або металічні сита, щоб позбутися від великих і щільних шматків калюсної тканини і крупних агрегатів.

Для глибинного культивування рослинних клітин користуються способами вирощування, які розроблені в мікробіології. Використовують закриті або відкриті системи в періодичному або протоковому режимах.

У закритій системі при періодичному режимі вирощування клітинна маса поміщається в певний об’єм середовища. До закінчення вирощування система залишається закритою за всіма параметрами окрім газів.

У закритій безперервній культурі у систему періодично подається свіже живильне середовище, а старе видаляється у тому ж об’ємі. Клітини залишаються в системі протягом всього періоду вирощування.

У відкриті протокові культури періодично поступає свіже середовище, однак відбирається не лише старе середовище, а й частина клітинної маси. Регуляція цього процесу може здійснюватися за принципом турбідостата або хемостата. У турбідостаті подача свіжого середовища і відбір суспензії відбуваються після досягнення клітинною суспензією певної заданої густини. Сигнал на включення поступає від реле, яке зв’язане з оптичною системою, що визначає густину суспензії. В хемостаті швидкість протоку задається експериментатором і від неї залежить швидкість росту клітинної маси. Режим хемостата дозволяє за допомогою фіксованої швидкості розбавлення підтримувати постійну швидкість поділу і густину клітин у популяції. Найпоширенішим режимом культивування клітинних суспензій є закрита періодична система. У цьому випадку для аерації і перемішування суспензії використовують різну апаратуру: ролери, шейкери (як правило колові), ферментери з механічними і магнітними змішувачами або ферментери барботажного типу, в яких аерація і перемішування здійснюється повітряним потоком.

Для роботи з суспензіями необхідно знати їхні характеристики: життєздатність, щільність клітин в суспензійній культурі, ступінь агрегованості, швидкість росту.

Життєздатність клітин визначають за їхнім забарвленням барвником (метиленова синь або синь Еванса). Живі клітини не фарбуються барвником так, як клітинні мембрани непроникні для нього. В мертві клітини фарба легко проникає, і вони забарвлюються у синій колір.

Одним із основних показників, які характеризують стан клітинної суспензії, є щільність клітинної популяції. Кількість клітин визначають в лічильній камері Фукс-Розенталя під мікроскопом після мацерації хромовою кислотою (10-20 %).

Звичайно пасаж культивування клітинної суспензії становить 14-16 днів. За цей час щільність зростає від 5·10⁴ до 5·10⁶ кл/мл.

Якість суспензії залежить від ступеня агрегованості її клітин. Агрегати не повинні містити більше 10-12 клітин. Для видалення крупних агрегатів суспензії фільтрують через марлеві, нейлонові або металеві фільтри. Водночас це дозволяє позбутися від залишків експлантата або щільних шматків калюсної тканини.