Белково-протеиназный комплекс муки

Понятие «белково-протеиназный комплекс зерна, муки или теста» охватывает белковые вещества, протеолитические ферменты и актива­торы или ингибиторы протеолиза. Эти компоненты белково-протеиназного комплекса в их взаимодействии в основном обусловливают со­стояние и изменения белковых веществ и в связи с этим реологические свойства теста.

Белковые вещества муки. Содержание в зерне, а отсюда и в муке, белковых веществ, их состав, состояние и свойства имеют первостепен­ное значение и в значительной мере определяют не только пищевую ценность хлеба, но и технологические хлебопекарные свойства пшенич­ной муки.

Отличительные особенности реологических свойств пшеничного теста, сочетающего упругость (эластичность) с пластичностью и вязко­стью, обусловлены именно белками муки. Ни крахмал, которого в муке около 70%, ни какая-либо другая, кроме белков, составная часть муки не способны при смешивании с водой образовывать массу, даже близ­кую по реологическим свойствам к пшеничному тесту.

 

 

Количество белковых веществ в зерне пшеницы может колебаться в широких пределах — от 7 до 26%.

Содержание в зерне белка связано с особенностями сорта пшени­цы. Однако зерно одного и того же сорта пшеницы может иметь резко различное содержание белка в зависимости от почвенно-климатических, погодных и агротехнических условий выращивания.

В состав белковых веществ зерна пшеницы и пшеничной муки вхо­дят в основном белки — протеины. В небольших количествах в них со­держатся и соединения белков с веществами небелковой природы — протеиды (липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды).

Современной рациональной классификации белковых веществ — протеинов — еще не разработано, поэтому применительно к белкам зер­на и муки до сих пор используется классификация, предложенная Осборном.

В основе этой классификации лежит подразделение белковых ве­ществ по их способности растворяться в разных растворителях. По это­му признаку белковые вещества подразделяют на приводимые ниже группы.

Альбумины — растворимые в воде. В качестве примеров приводим некоторые из них: лейкозин — белок зародыша пшеницы, легумелин — семян гороха и овальбумин — белок яйца.

Глобулины — растворимые в растворах солей, например в 10%-ном растворе хлорида натрия. К числу глобулинов относят: легумин — бе­лок гороха, лактоглобулии — белок молока и др.

Проламины — растворимые в 60-80%-иом (обычно 70%-ном) во­дном растворе этилового спирта. К проламинам относят: глиадин — бе­лок зерна пшеницы и ржи, гордеин — ячменя, зеин — кукурузы, овенин — овса и др.

Глютелины — растворимые в 0,1-0,2%-ном растворе щелочей. Глютелинами являются: глютенин — белок зерна пшеницы и ржи, оризенин — риса и др.

Еще несколько десятков лет тому назад альбумин, глобулин, глиа­дин и глютенин зерна рассматривались как индивидуальные белки. По­следующие исследования установили, что все эти четыре вещества мно­гокомпонентны и каждое из них соответствующими методами может быть разделено на многие (до 20 и даже более) компоненты (субъедини­цы), отличные по молекулярной массе, структуре и другим свойствам.

Поэтому правильнее рассматривать альбумин, глобулин, глиадин и глютеиин зерна пшеницы и ржи как многокомпонентные фракции бел­ка зерна, искусственно выделяемые из него с помощью указанных выше соответствующих растворителей.

Соотношение альбумина, глобулина, глиадина и глютенина в белке зерна пшеницы и муке из него может существенно колебаться..

 

Глиадин и глютенинв воде нерастворимы и поэтому при отмыва­нии из муки клейковины являются основными ее компонентами. В свя­зи с этим их иногда называют «клейковидными белками». Глиадин и глютенин сосредоточены в белке эндосперма зерна. Альбумин же и гло­булин в основном находятся в белке зародыша и алейронового слоя зер­на. Исходя из этого в пшеничной муке высоких выходов (обойной и II сорта) доля альбуминовой и глобулиновой фракции значительно выше, чем в муке I и высшего сортов.

Достоверно то, что примерно от ⅔ до ¾ белка зерна пшеницы и муки из нее представлено его глиадиновой и глютениновой фракциями. При этом содержание глиадиновой фракции несколько выше, чем глютениновой. Остальная часть белка зерна пшеницы представлена в основном его альбуминовой и глобулиновой фракциями.

По данным, приводимым Е. Д. Казаковым и В. Л. Кретовичем [10, с. 38], в белке зерна пшеницы альбуминовой фракции содержится 20-22%, глобулиновой 5-6%.

Молекулярная масса альбуминовой, глобулиновой, проламиновой (глиадин) и глютелиновой (глютенин) фракций, а также содержащихся в них компонентов различна в весьма широком диапазоне — от 10 тысяч до нескольких миллионов. Полагают, что у глютенина средняя молеку­лярная масса находится в пределах от 1,5 до 2 млн.

Частицы белкового вещества с молекулярной массой ниже 5-6 ты­сяч именуют уже не белками, а пептидами.

Молекулярная масса рассматриваемых фракций белка зерна, а так­же диапазон их «разброса» и степень сложности структуры наимень­шие у альбуминовой и глобулиновой фракций, существенно большие у глиадина и наибольшие у глютенина.

Канадские исследователи¹ белка зерна пшеницы ввели еще одну дополнительную стадию его фракционирования.

Они провели далее исследования на 26 пробах зерна пшеницы, существенно различных по силе. Зерно размалывалось в муку, в которой определяли содержание белка; по методике Осборна в белке определяли содержание альбуминов, глобули­нов, глиадина и глютенина. Выделенную глютениновую фракцию дополнительно фракционировали по растворимости в 0,1 н. водном растворе уксусной кислоты.

Растворимая часть глютенина рассматривалась как глютенин I, а нераствори­мая — как глютенин II. При этом в исследовавшихся пробах муки доля массы глюте­нина I (в % к общей массе белка в пробе муки) составляла от 6 до 27,5%, а доля глюте­нина II - от 15 до 37%.

В этих же пробах муки различия в соотношениях в белке муки альбуминов, глобулинов и глиадина не были статистически существенными. Из тех же проб муки ремикс-методом выпекали хлеб, объем которого выражался в процентах к единице массы белка в пробе муки. Между величинами таким образом выраженного объема

Кhan К., Вuschuk W.Glutenin: Structure and Functionality in Bread-making — Сегеа1 Chemistry. - 1978. - № 2. - Р. 14-20.

 

хлеба и доли в белке муки глютенина I и глютенина II была установлена четко выра­женная обратная или прямая зависимость. Чем больше в белке муки глютенина I, тем ниже величины объема хлеба на единицу массы белка муки (коэффициент кор­реляции r был равен минус 0,86). Чем больше было содержание глютенина II, тем бо­льше был объем хлеба (r + 0,85) Из этого было сделано заключение о том, что чем бо­льше в белке муки глютенина II, тем больше будет объем хлеба при этом же содержа­нии общего белка.

Следовательно, чем больше в пшеничной муке белка и чем больше в этом белке глютениновой фракции, а в ней глютенина II, тем сильнее мука.

В числе белковых веществ зерна пшеницы и пшеничной муки, кро­ме собственно белков (или протеинов), содержатся и протеиды — сое­динения белка с веществами небелковой природы, которые называют простетической группой. Протеиды подразделяют по химической при­роде их простетической группы. Так, у липопротеидов она представлена липидами, у гликопротеидов — углеводами, у нуклеопротеидов — нукле­иновой кислотой. Наличие в зерне пшеницы и в пшеничной муке ли­попротеидов и гликопротеидов и их функциональные свойства, как бу­дет показано далее, также влияет на силу пшеничной муки.

Протеолитические ферменты муки, их активаторы и ингибиторы. Протеолитические ферменты муки. Ферменты, гидролитически рас­щепляющие белки (протеины) по их пептидным связям, называют протеиназами.

При действии протеиназы на белок в качестве продуктов гидроли­за образуются пептоны, полипептиды и свободные аминокислоты.

В зерне пшеницы, ржи и других злаков, как установлено рядом ис­следований, содержится протеиназа, относимая к протеолитическим ферментам типа папаиназ. Для протеина этого типа характерна их спо­собность активироваться соединениями восстанавливающего дейст­вия, в частности соединениями, содержащими сульфгидрильную груп­пу — SН (цистеин, глютатион). Столь же характерна способность про-теиназ этого типа инактивироваться соединениями окислительного действия (КВгО₃, КJО₃, Н₂О₂, кислород воздуха и др.).

Таким образом, указанные соединения восстановительного дейст­вия являются активаторами, а окислители — ингибиторами протеолиза.

Разрыв пептидной связи белка при гидролитическом действии протеиназы приводит к образованию свободных аминной и карбокси­льной групп. Поэтому об интенсивности протеолиза биохимики часто судят по приросту числа свободных аминныхили карбоксильных групп, определяемому соответствующими химическими методами.

Уже в первые годы исследования действия протеиназ на клейкови­ну и тесто из пшеничной муки было установлено влияние протеиназы на реологические свойства этих объектов. Действие протеиназына клейковину и тесто вызывало очень сильное их разжижение, пониже-

ние упругости и увеличение текучести. В то же время количество сво­бодных аминокислот и карбоксильных групп возрастало очень незна­чительно или даже оставалось неизменным.

Из этого можно заключить, что по меньшей мере начальной фор­мой действия протеиназы является не разрыв пептидных связей полипептидных цепочек белка, а дезагрегация белка, нарушение его четвер­тичной и третичной структур, а может быть и отдельных элементов вто­ричной его структуры.

Учитывая в основном дезагрегирующее действие протеиназы муки, для хими­ческой характеристики ее активности было признано целесообразным определение количества водорастворимого азота и азота, не осаждаемого трихлоруксусной кис­лотой, накапливающегося в водно-мучной смеси в результате протеолиза. Эти пока­затели значительно лучше характеризуют активность протеиназы муки и протеолиз мучного белка, чем показатели накопления аминных или карбоксильных групп, об­разующихся только в конечной стадии протеолиза, до которой процесс чаще всего и не доходит.

Принято считать, что протеиназа пшеничной муки имеет зону оптимума рН в пределах 4-5,5 и температурный оптимум около 45 "С.

Следует отметить, что величины оптимума рН и температуры не только протеиназы, но и амилаз и других ферментов могут быть различными для разных условий. Так, оптимум температуры может сдвигаться не только в зависимости от рН среды, но и от соотношения в ней субстрата и воды, от содержания в ней защитных коллои­дов, а также от скорости и длительности прогрева. Это подтверждается исследовани­ями действия протеиназы муки в реальных условиях пшеничного теста, показавши­ми, что температурный оптимум действия протеиназы в тесте из пшеничной муки II сорта при влажности теста 50% равен примерно 70 °С, а при влажности теста 70% снижается до 50 °С. Эти данные получены при выдержке теста в течение 15 мин. Уве­личение длительности прогрева до 30 мин заметно снижало значения оптимума тем­пературы.

Было установлено, что при 15-минутной длительности прогрева теста (рН 5,8) при 95 °С не происходило еще полной инактивации протеиназы. Следовательно, в центральных слоях мякиша даже готового пшеничного хлеба может сохраняться очень незначительная протеолитическая активность.

Исследованиями, проведенными в 1975—1980 гг. в МТИППе (В. Л. Кретович, М. П. Попов, Е. Ф. Шаценко и др.). показано, что в зер­не пшеницы имеются и могут играть существенную роль и протеолитические ферменты с оптимумом рН 6,75. Поэтому их назвали нейтраль­ными протеииазами.

Было установлено, что в зерне пшеницы содержатся также вещества белковой природы, могущие ингибировать действие нейтральных протеиназ. В нормально со­гревшем зерне пшеницы активность нейтральной протеиназы и ее ингибиторов хо­рошо уравновешена. Полагают, что нейтральные протеиназы играют большую роль в процессе мобилизации запасных белков семян пшеницы при их прорастании. Ингибируют действие нейтральной протеиназы также поваренная соль и ингибиторы протеолиза, в том числе и термостабильные, содержащиеся в клеточном соке карто­феля. Нейтральные протеиназы сохраняют часть своей активности и при величинах

рН пшеничного теста. Поэтому целесообразно продолжать исследование их роли при брожении и созревании пшеничного теста и влияния на свойства теста и качест­во хлеба.

Активаторы и ингибиторы протеолиза. Способность папаина и протеиназы зерна и муки активироваться восстановителями и инактивироваться окислителями связана с наличием в структуре белковых молекул этих ферментов групп —SН. Превращение этих групп при окислении в дисульфидные связи-мостики инактивирует фермент.

Активен же фермент только в его восстановленном состоянии, с на­личием в его структуре групп —SН.

Активатором протеолиза, содержащимся в зерне, муке и дрожжах, а следовательно, и в тесте, является глютатион.

Глютатион представляет собой трипептид, в состав которого вхо­дит остаток цистеина, содержащий группу —SН. Если обозначить моле­кулу глютатиона как G—SН, то его окислительно-восстановительное превращение происходит по схеме

 

2G-SH↔G−S−S−G

В окисленном состоянии глютатион уже не способен активировать протеолиз. Еще в 1935 г. Иоргенсен показал, что протеиназа, имеющая­ся в муке в достаточном количестве, при отсутствии активаторов (глю­татиона или цистеина) малоактивна. Добавление же указанных актива­торов резко усиливает протеолиз и вызванное им разжижение теста. Это было показано и в ряде работ, проведенных советскими исследова­телями. Активирующее протеолиз действие таких восстановителей, как глютатион (или цистеин), сводится к восстановлению — SН-групп, на­ходившихся в неактивной протеиназе в виде связи.

Отдельные исследователи еще в начале исследования протеиназ и протеолиза теста указывали на возможность и прямого действия —SН-содержащих восстановителей и окислительных реагентов па бел­ковые вещества муки и теста. В настоящее время это показано многочи­сленными исследованиями и общепризнано.

В составе и структуре белкового вещества зерна и муки содержатся остатки и аминокислот цистеина и цистина, а поэтому и группы —SН и —S—S—связи.

Роль дисульфидных —S—S—связей (мостиков) особенно сущест­венна в третичной и четвертичной структуре белкового вещества.

Образование дисульфидных связей упрочняет внутри-молекуляр­ную (внутриглобулярную) структуру белка, делая ее более плотной и жесткой. Разрыв же дисульфидиых связей вызывает ослабление струк­туры молекулы (глобулы) белка, делая ее более «рыхлой» и подвиж­ной.

Вероятно, влияет также образование и разрыв дисульфидных свя­зей и на более крупные надмолекулярные образования — агрегаты из ряда молекул белка.

Естественно, что различия в плотности и прочности структурных образований белка меняют не только реологические свойства белково­го вещества, по и его состояние как субстрата, на который действует протеиназа. Упрочнение структуры белкового вещества снижает, а ослабление и «разрыхление» увеличивает его атакуемость протеиназой.

Содержание, изменения и роль —SH-групп и —S—S—связей белковых ве­ществ зерна, муки и теста изучались очень многими исследователями.

Установлено, что в белках зерна, муки и теста содержатся как — SН-группы, так и —S—S—связи (в сумме примерно до 40 мк-экв./г белка). Как абсолютное содержа­ние, так и соотношение этих двух видов групп в белках отдельных сортов и образцов муки в известных пределах колеблется.

Однако можно считать установленным, что количество —3—8—связей намно­го превышает количество —SН-групп. Так, количество —5 -3—связей в белках клейковины может превышать количество —SH-групп в 10 и даже в 25 раз.

Таким образом, количество сульфгидрильных групп, из которых при действии окислительных агентов могут образовываться дополнительные дисульфидные свя­зи, относительно невелико.

Вопрос о возможном в этих условиях механизме улучшающего действия окис­лителей на структуру и физические свойства белка, клейковины и теста будет рас­смотрен в последующих главах. Здесь мы отметим, что как общее количест­во —SН-групп, так, в частности, и содержание восстановленного глютатиона (О—SН) в отдельных частях зерна неодинаково. Установлено, что вещества, содер­жащие —SН-группы, размещены в основном в периферических частях зерна (в алей­роновом слое и особенно зародыше).

При прорастании зерна содержание в нем восстановленного глютатиона резко увеличивается, в результате чего сильно повышается протеолитическая активность этого зерна.

Установлено, что даже из относительно небольшого количества —SН-групп белков теста известная часть является «скрытой» (недоступной) и практически не участвующей в окислительно-восстановительных реакциях и взаимопревращениях.

Другие соединения и факторы, влияющие на компоненты белково-протеиназного комплекса муки. Основная часть цистеина и глюта­тиона, как указывалось выше, содержится в муке в окисленной форме (цистин или G—S—S—G), в которой они не способны пи активировать протеиназу, ни непосредственно своим восстановительным действием разрывать дисульфидные связи в структуре белкового вещества.

В зерне пшеницы и муки из него содержатся иферменты цистинре-дуктаза и глютатионредуктаза, которые являются дисульфидредукта-зами.

Наличие этих ферментов в муке не может не влиять на количест­во —SН-групп в белках, а следовательно, и на их структуру, физические свойства и ферментативную атакуемость.

Есть экспериментальные данные, указывающие на то, что приобре­тение белками зерна пшеницы свойств, обусловливающих компактную и прочную структуру и реологические свойства, характерные для «си­льных» пшениц, связано с активностью и действием ферментов каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы и аскорбиноксидазы в период ве­гетации растения и формирования зерна.

Роль водородных связей в качестве фактора, могущего влиять па структуру белкового вещества зерна и муки и в итоге па реологические свойства клейковины и теста, была экспериментально мало исследова­на. Высказывались лишь предположения о том, что эти относительно слабые и очень лабильные связи должны, очевидно, влиять на структу­ру и реологические свойства белкового вещества муки, клейковины и теста.

Прямые эксперименты показали, что водородные связи также иг­рают определенную роль в создании структуры и свойств клейковинного белка. Замена в белке водорода дейтерием увеличивает энергию во­дородной связи, заметно и закономерно влияя на реологические свой­ства клейковины, «усиливая» ее. Установлено, что такое изменение энергии водородных связей вызывает и соответствующие изменения реологических свойств пшеничного теста.

Рядом работ выявлено, что в структуре белкового вещества муки известную роль могут играть и соединения белка с восстанавливающи­ми сахарами — так называемые гликопротеиды.

Образование таких комплексных соединений может приводить к возникновению в третичной и четвертичной структурах белкового ве­щества еще одного вида дополнительных связей — углеводных связей-мостиков, также упрочняющих структуру белкового вещества.

Липиды (жиры и жироподобные вещества) также способны обра­зовывать соединения (комплексы) с белками — липопротеиды. Эти сое­динения также играют определенную роль в структуре и реологических свойствах макрообразований белкового вещества, а отсюда и в реологи­ческих свойствах клейковины и теста.

Имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что фермент липоксигеназа, содержащийся в известных количествах в зерне и муке, также может через посредство образуемых им перекисей нена­сыщенных жирных кислот принимать участие в окислении —SН-грунп белка зерна, муки и теста, а следовательно, влиять на их структуру и ре­ологические свойства.