Задания для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить мазки из смеси культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, окрасить по Граму, изучить под микроскопом.

       Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выяснить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму. Все бактерии по отношению к окраске по Грамму делятся на грамположительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного. Способность микроорганизмов окрашиваться в тот или иной цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которой нет у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генциан-виолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется.

Техника окраски по Граму.

- окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

- бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

- окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

- раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

- тщательно смыть спирт водой;

- окрасить водным фуксином 2 мин);

- промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

       Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а так же высоким содержанием липидов и кальция.

       Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом.

Техника окраски спор по методу Ожешко.

- нанести несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин);

- слить кислоту, промыть водой, высушить;

- зафиксировать в пламени;

- окрасить по методу Циля-Нельсена (при этом споры окрашиваются красный цвет, а вегетативные формы – в синий).

Техника окраски по методу Циля-Нельсена.

- нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров (3-5 мин);

- бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% раствором серной кислоты и 3% раствором солянокислого спирта (2-4 с);

- тщательно промыть водой;

- окрасить синькой Леффлера (3-5 мин);

- промыть водой и высушить споры.

Кислотоустойчивые бактерии, в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а все остальные – синими.

2. Приготовить мазок по методу Бурри-Гинса, промикроскопировать, зарисовать.

Многие виды микроорганизмов обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Техника обнаружения капсул по методу Бурри-Гинса.

- приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить мазок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% спирт и поджечь);

- окрасить препарат водным фуксином (1-2 мин);

- промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на черно-розовом фоне.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности и т.д.

3. Изучить нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска.

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют его.

Техника метода «раздавленной капли».

- на середину предметного стекла нанести петлей каплю исследуемого материала, накрыть ее покровным стеклом;

- рассмотреть в микроскопе с темным полем зрения, с объективом х40.

Техника метода «висячей капли».

- каплю исследуемого материала нанести на середину покровного стекла;

- быстро повернуть его каплей вниз и наложить на предметное стекло с углублением («лункой») в середине, причем капля должна свисать в углубление, не соприкасаясь с дном и краями;

- промикроскопировать.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 2. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 3. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 4.  Дифференциация бактерий с помощью окраски по Граму. 5. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 6. Техника окраски микробов по Граму. 7. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 8. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки). 9. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера-Фултона, Ожешко, Циля-Нильсена, Бури-Гинса, Нейссера. 10. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 11. Этапы методов «висячей» и «раздавленной» капли.