Микрофлора мяса и мясопродуктов

Занятие 1. Проведение бактериологического исследования образ­цов мяса в соответствии с действующим ГОСТом. Посев на селективные среды

Отбор проб. В зависимости от характера заболевания на микробиологическое исследование направляют следующие пробы от туши: часть мышцы сгибателя или разгибателя перед­ней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8х6х6 см; лимфатические узлы — поверхностный шейный или собственно подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соедини­тельной и жировой тканями, а от свиней поверхностный шей­ный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый 1-го ребра и надко­ленный; долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи; почку и селезенку.

Для исследования на сибирскую язву направляют лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации пораженного очага, отечную ткань, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.

При исследовании полутуши или четверти туши берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.

Образцы упаковывают каждый в отдельности в полиэтилено­вую пленку или пергамент, помещают во влагонепроницаемую тару, ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию.

При пересылке образцов мяса в лабораторию, расположенную за пределами предприятия, тару с образцами опечатывают или пломбируют. В сопроводительном документе указывают наименование предприятия и его адрес, наименование и номер образца, вид животного, причину направления материала на исследование, краткие патологоанатомические данные и предполагаемый диагноз, дату взятия образцов, подпись лица, направившего образец на исследование.

 

При бактериологическом исследовании каждую пробу осво­бождают от жировой и соединительной тканей, погружают в спирт, затем вырезают стерильными ножницами из глубины раз­личных мест кусочки 2,0х1,5х2,5 см, лимфатические узлы разре­зают пополам. Затем:

а) все вырезанные кусочки измельчают сте­рильными ножницами. Для посева составляют пробы по 15 г каждую. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатичес­ких узлов, а другая — из кусочков паренхиматозных органов. Из каждой пробы готовят в стерильной ступке взвесь с содержанием в 1 см³ 0,5 г продукта. Для выявления возбудителей зооантропонозов из верхней части надосадочной жидкости пастеровской пипеткой или бактериологической петлей на поверхность МПА в чашки Петри вносят 1...2 капли взвеси, шпателем растирают по поверхности среды по методу Дригальского.

Для выявления бактерий группы кишечных палочек проводят посев аналогичным методом на дифференциально-диагностичес­кую среду Эндо, Плоскирева или Левина, Вильсон – Блера.

б) Каждую пробу разрезают на две части и бактериологической петлёй делают соскоб с внутренней поверхности разреза. Материал находящийся на бактериологической петле растирают по поверхности выбранной, плотной питательной среды по методу Дригальского.

в) Каждую пробу разрезают на две части и захватив одну из них накладывают отпечатки на поверхность выбранной, плотной питательной среды (как приготовление мазков –отпечатков)

       На присутствие анаэробов мясо исследуют только в том случае, когда есть подозрение на наличие анаэробных инфекций (эмкар, и т.п.).

Материалами для исследования на присутствие возбудителей эмкара и злокачественного отека служат кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, при ботулизме — содержимое желудка, толстого отдела кишечника, селезенка, печень.

Для посева берут 3...5 см³ приготовленной, взвеси, вносят в четыре пробирки со средой Китта—Тароцци, предварительно прогретой на кипящей водяной бане в течение 20...30 мин, а затем охлаждают до 50 "С. Две пробирки с посевами прогревают при 80 "С в течение 20 мин для выявления всех анаэробов. При исследовании на Cl. botulinum типа Е одну пробирку подогревают до 60 °С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры Cl. botulinum типа Е), а другую — при 80 °С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

Для выявления Cl botulinum типа Е посевы выдерживают при 28 °С, а для обнаружения других анаэробов — при 37 °С. Термостатирование проводят в течение 5...10 сут, наблюдение за рос­том культур — ежедневно.

Задание 1. Провести лабораторную диагностику пищевых бактериальных отравлений (I этап): посеять мясо или фарш на селенитовый бульон, на среду Эндо, висмут-сульфитную среду, в конденсат скошенного агара (посев по Щукевичу), в среду Китта-Тароцци, (табл 6). Начать оформле­ние протокола исследования.

Материалы и оборудование. Чашка Петри с фаршем - 5 г, стерильная фарфоровая ступка, пробирка с 2 г стерильного песка, колба с 50 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, колба с селенитовой средой- 40 мл пипетки на 1-2 мл и 5-10 мл, чашка Петри со средой Эндо, чашка с висмуг-сульфитной средой, пробирка со свежескошенным мясопептонным агаром, со средой Китга-Тароцци, пробирка с 6,5% солевым бульоном, чашки Петри с кровяным, молочно-солевым и желточно-солевым агарами.

Методические указания к выполнению работы. Обнаружение сальмонелл в мясе и колбасных изделиях проводиться из объема 5 г, взятого из нескольких кусочков внутренней и наружной проб (части) полуфабриката или готового кулинарного изделия. Пробу измельчают с помощью гомогенизатора или в стерильной фарфоровой ступке с 2-3 г стерильного песка, приливая 45 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия: в 1 мл исследуемой взвеси содержится 0.1 г продукта. 10 мл исследуемой взвеси вносят в колбу с 40 мл обогатительной среды. Одновременно высевают по 0,1 мл на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Посевы инкубируют при 37°С 18-24 ч.

При определении бактерий рода Р г о t e u s   взвесь продукта в количестве 0,5 мл вносят в конденсат свежескошенного мясопептонного агара (разлитого по широким пробиркам), не затрагивая скошенной поверхности среды. Штатив с пробиркам помещают в термостат.

При определении к л о с т р и д и й по 0,1 мл исследуемой взвеси продукта вносят стерильно на дно пробирки с прогретой при 100 ⁰С в течение 25 минут и охлажденное до 40°С средой Китта - Тароцци и в пробирку с той же средой, которую после посева нагревают на водяной бане течение 20 мин при 80°С с целью теплоктавации спор и уничтожения вегетативных клеток неспорообразующих бактерий. Посевы культивируют при 37°С до 5 суток, ежедневно просматривая появление роста клостридий, что сопровождается помутнением среды и выделением газа.

Таблица 6

Схема исследования пищевых продуктов при бактериальных отравлениях

Микроорга-	Посев на питательные сре	Характер роста после первичного по-
низмы, выде-	ды в 1-й день исследования	сева
ляемые из пи-
щевых продук-
тов
Сальмонеллы	1 Селенитовый бульон	1. Помутнение
	2Висмут-сульфитная среда	2. Колонии с металлическим блеском,
		иногда зеленоватые, прокрашивающие в
		черный цвет среду под колонией
		3.Бесцветные или слегка розовые коло-
	3. Среда Эндо	НИИ
Энтеропатоген-	1 Среда Эндо	1 Рост колоний красного цвета с метал-
ные		лическим оттенком
эшерихии	2. Среда Кесслера	2. Помутнение среды
	(для определения колииндекса)
Протей	Мясопептонный агар	Вуалеобразный (ползучий) рост
	(по Щукевичу)
С. perfringens	Среда Сидоренко -	В пробирках интенсивное
	Пивоварова	почернение среды
Энтерококки	Молочно-ингибиторная среда с	Колонии правильной формы (1,5-2 мм)
	полимиксином и теллуритом	с зоной протеолиза и черной или серой
	калия	Окраской
Патогеные ста-	1. Молочно-солевой агар, жел-	I. Колонии правильной формы (2-4 мм);
филококки	точно-солевой агар	цвет от белого до оранжевожелтого на
		желточно-солевом агаре - ореол коа-
		гулята (действие фермента лецитиназы)
		2. Диффузный рост
	2.Среды обогащния: солевые
	бульоны с 6,5 и 10 % хлорида
	натрия; сахарный
	бульон с 1% глюкозы
Bacillus cereus	Среда Донована	Крупные плоские белые колонии со слег-
		ка изрезанными краями и окруженные
		зоной матового коагулята (положитель-
		ная реакция на лецитиназу)

Примечание. Последующее выделение и идентификация чистой культы ведутся по обычной схеме.

Сальмонеллы образуют на среде Эндо бесцветные или с розоватым оттенком колонии, а на висмут-сульфитном агаре - серо-зеленые колонии с черным центром и подкрашенной в черный цвет средой под колонией. В случае отсутствия роста колоний, характерных для сальмонелл, делают высев на эти же среды из селенитового бульона.

Колонии, характерные для сальмонелл, пересевают на среду Ресселя штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик среды. При росте сальмонелл исходный цвет скошенной поверхности среды не изменяется, изменяется только цвет столбика среды. Газообразование определяют по разрыву столбика.

На свежескошенном мясопептонном агаре бактерии рода протея образуют вуалеобразный налет с голубоватым оттенком» издают неприятный гнилостный запах. Для установления вида протея применяют соответствующие агглютинирующие сыворотки.

Со сред Китта - Тароцци для обнаружения клостридий проводят бактериоскопию мазков, окрашенных по Граму. Подтверждающим исследованием является также высев 1-2 капель культуры в расплавленную и остуженную до 45°С среду Вильсона - Блера, которую выливают в стерильную чашку Петри и после застывания заливают слоем голодного агара толщиной не менее 5 мм. Рост колоний черного цвета указывает на присутствие клостридий.

При обнаружении стафилококков окрашивают по Граму мазки из колоний, выросших на молочно-солевой среде. Колонии грамположительных кокков отсевают на скошенный мясопептонный агар (выделение чистой культуры) и подращивают сутки при температуре 37°С. Выделенную чистую культуру стафилококков испытывают на плазмокоагулазу (посев в плазму), которая вызывает образование сгустка, и лецитовителлазу (посев на желточно-солевой агар) - по образованию вокруг колоний матового коагулянта в результате действия фермента на лецитовителлин желтка. При отсутствии роста коагулазоположительных стафилококков на молочно-солевом агаре исследуют колонии, выделенные со сред обогащения. Для этого производят высев из сред обогащения на сектора плотных питательных сред (кровяной агар, желточно-солевой агар).

Колонии коагулазоположительных стафилококков подлежат подсчету и перерасчету на 1 г продукта.

Таблица 7

Оценка степени свежести сырого мяса

Степень свежести мяса	Показатели бактериоскопической пробы (в поле зрения микроскопа)
Свежее	Микроорганизмы не обнаруживаются или имеются лишь единичные (до 10 клеток) коккии палочки. Следов распада мышечной ткани нет
Сомнительной свежести	Обнаруживаются не более 30 кокковили палочек, а также следы распада мышечной ткани: ядра мышечных волокон в состоянии распада, исчерченность волокон слабо различима
Несвежее	Обнаруживается свыше 30 кокков или палочек. Наблюдается значительныйраспад мышечной ткани: почти полное исчезнове­ние ядер и полное исчезновение исчерченности мышечных во­локон

Оформление альбома. Записать результаты в табл. 1,2.3,4 и заключение в табл. 7,8,9. Закончить протокол исследования на наличие сальмонелл в воде. Записать табл. 10,11. Составить протокол «Исследование фарша для обнаружения бактерий, вызвавших пищевое отравление» (см. табл.7). Зарисовать: 1) микрофлору кефира, 2) микрофлору сметаны, 3) энтерококки.

Контрольные вопросы:

1. Правила отбора молока для микробиологического исследования.

2. Расскажите о бактериологическом исследовании сметаны и кефира

3. Расскажите о схеме исследования пищевых продуктов при бактериальных отравле­ниях

Занятие 3