Выделение и идентификация культуры возбудителя. Микроскопическое исследование исходного материала, обнаружение антигенов и ДНК возбудителя

Микроскопическое исследование исходного материала, обнаружение антигенов и ДНК возбудителя

Бактериологическое исследование

Лабораторная диагностика мелиоидоза

Мелиоидоз (ложный сап) — редко встречающееся инфекционное заболева­ние некоторых видов животных и человека в районах Юго-Восточной Азии, северных провинциях Австралии, в виде спорадических случаев в странах Европы, Африки, Северной Америке, Китае, В РФ мелиоидоз не регистрируется. Мелиоидоз характеризуется лихорадкой, катаральногнойным воспалением слизистых оболочек, образованием казеозных узел­ков и гнойных очагов в различных органах и тканях. В естественных усло­виях восприимчивы к мелиодозу грызуны, собаки, кошки, свиньи, овцы, крупный рогатый скот, лошади, ослы, а также человек. Возбудителем бо­лезни является грамотрицательная палочковидная бактерия Burkholderia pseudomallei, род Burkholderia, ранее Pseudomonas pseudomallei. Лабораторная диагностика болезни основана на результатах бактериоло­гического и серологического исследований.

Материалом для бактериологического исследования при жизни служат: гнойное отделяемое язв, содержимое абсцессов, кровь, моча, мокрота, вы­деления из носовых отверстий, глаз. Посмертно берут участки поражен­ных тканей, кровь, кусочки внутренних органов, лимфатические узлы. Взя­тие и пересылку материала проводят согласно режиму работы с особо опас­ными инфекциями.

Из материала готовят мазки для окраски по Граму, люминесцентно-серологического и иммуноферментного исследования. В положительных случа­ях в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают полиморфные, грамотрицательные, нередко биполярные палочковидные бактерии с закруглен­ными концами размером 3-6х0,3-0,6 мкм. Клетки возбудителя окруже­ны массивной слизистой капсулой. По данным ученых, присутствие капсулы отражает определенный антигенный состав и виру­лентность возбудителя. Апробирована ПЦР с целью выявления ДНК воз­будителя в исследуемом материале.

Культивирование. В. pseudomallei — факультативный анаэроб, температурный опти­мум 37° С, диапазон 14-44° С, рН питательных сред 6,8-7,0, диапа­зон 5,6-8,5. Возбудитель не требователен к питательным средам, но лучше растет на субстратах с добавлением 4-5% глицерина. Обычно посев производят на мясопептонный агар и бульон с глицерином. Кон-таминированный материал рекомендуется в течение 3 часов обработать пенициллином (1000 ЕД/мл) и высевать на М ПА с кристаллвиоле-том (1:200 000), на синтетическую среду с Р-аланином и неомицином. Посевы инкубируют при 37° С, в аэробных условиях в течение 5-6 суток, ежедневно просматривая. В.pseudomallei, в отличие от В.mallei, не способен расти при 42° С.

Отличительной особенностью В.pseudomallei от В.mallei является способ­ность к росту на средах без глицерина. В положительных случаях на МПА с глицерином через сутки инкубирования формируются мелкие, полупроз­рачные, сероватого цвета колонии с ровными краями, выпуклые, с глад­кой поверхностью, которые напоминают колонии эшерихий, но более мел­кие. На кровяном агаре некоторые штаммы вызывают а -гемолиз. Нередко вырастают крупные слизистые колонии, диаметром до 6 мм, правильной круглой формы, выпуклые, слегка опалесцирующие. Наиболее часто ко­лонии этой морфологии образуются при исследовании мокроты.

На вторые сутки и позднее колонии теряют прозрачность, проявляются признаки диссоциации: часть колоний остаются блестящими, гладкими, с ровными краями, у других формируется шероховатая или складчатая по­верхность, неровный, зубчатый край, они отдаленно напоминают старые колонии микобактерий туберкулеза. Таким образом, в посевах могут присутствовать S-, R-, М- и промежуточные фор­мы колоний.

В МПБ рост возбудителя через 10-12 часов характеризуется легким помутнением среды, через 24-30 часов помутнение становится сильным, образуется осадок и поверхностная пленка, которая спустя 4-5 суток делается складчатой, превращается из серо-желтоватой в коричневатую, после добавления нейтрального красного пленка окрашивается в оран­жево-красный цвет. Культуры В.pseudomallei имеют специфический за­пах плесени.

Морфологические и тинкториальные свойства B.pseudomallei в культуре. В мазках из культуры клетки возбудителя имеют морфологию, сход­ную с наблюдаемой в патологическом материале; клетки мелкие, распо­лагаются единично, парами, короткими цепочками, «обоймами» по 5-7 штук. При старении культур образуются скопления по 8-10 штук, объе­диненные слизистой массой; клетки с возрастом удлиняются, появляется зернистость, одновременно обнаруживаются коккобактерии. Для клеток, окрашенных по Граму и другими анилиновыми красителями, характерна биполярность, спор не образуют, подвижны, движение клеток прямоли­нейное или змеевидное. На сывороточных средах возбудитель образует капсулу.

Идентификация B.pseudomallei по ферментативным свойствам. Для В. pseudomallei характерно наличие аргиниидигидролазы, оксидазы, желатиназы, гидролиз крахмала, денитрифицирующая активность, использование глюкозы, трегалозы, мезо-инозитола, d-валина, β-аланина,
d-аргинина, Д-рибозы, левулината, эритритола, а-амиланина, инертность по отношению к гераниолу, Д-ксилозе, d-рамнозе, сахарату, цитроконату, мезаконату, Д- и мезо-тартрат. Критерии диффе­ренциации В.pseudomallei представлены в таблице 79. Согласно этим данным, для возбудителя мелиоидоза свойственна, в отличие от В. mallei, способность образовывать газ из нитрата (100% штам­мов), кислоту на скошенном агаре TSI (72% штаммов), расти на среде Симмонса (77% штаммов), разжижать желатину (79% штаммов), изменять лак­мусовое молоко (96% штаммов).

Отмечается непостоянство утилизации В. pseudomallei органических соединений. Причина такого явления окончательно не выяснена, как постоянный признак может рас­сматриваться окисление галактозы, маннозы, эскулина, амидона, декст­рина; непостоянный — окисление арабинозы, ксилозы, глюкозы, левуле­зы, лактозы, мальтозы, трегалозы, раффинозы, глицерина, маннита, ину­лина; постоянно отрицательный — отсутствие окисления рамнозы, саха­розы, салицина, дульцита, инозита, сорбита, адонита. Система комбини­рованного тестирования ферментативной активности API 20 Е позволяет идентифицировать только 50-63% штаммов возбудителя. Более эффективны системы Minitek и ЕРА — 18 NF. Несовершен­ство методов идентификации возбудителя по фенотипическим признакам подтверждает перспективность молекулярно-генетической диагностики мелиоидоза.

Серологическая идентификация возбудителя. На различных этапах бактериологического исследования может быть использован метод флуоресцирующих антител, РНГА, ИФА. При просмот­ре первичных посевов на плотных питательных средах отбирают «подозри­тельные» колонии и проверяют их в РА на стекле. Коммерческая иммунная мелиоидозная сыворотка агглютинирует в разведении до 1:160 культуры всех известных штаммов В. pseudomallei. В РА, при использовании поликлональной сыворотки, нельзя дифференцировать В. mallei и В. pseudomalei. Возбудитель тиелиоидоза имеет антигены, родственные довольно широко­му кругу гетерологичных видов бактерий, но наиболее близок по спектру антигенов с В. mallei. По результатам РА отбирают культуры для дальней­шего изучения ферментативных свойств с целью окончательной идентифи­кации.

Биопроба. Проводят с целью выделения культуры возбудителя из исследуемого матери­ала и установления патогенных свойств изолированной культуры. Биопробу проводят на морских свинках, золотистых хомяках и крысах (крысы резистентны к В.mallei). Если материал не загрязнен посторонней микрофлорой, то его вводят животным внутрибрюшинно, в противном случае — подкожно или наносят на скарифицированную кожу. Морским свинкам и крысам вво­дят соответственно по 1,0 и 0,5 мл суспензии исследуемого материала. При наличии возбудителя на месте введения материала у животных развивается отек, некроз ткани, иногда образуется язва, увеличиваются лимфатические узлы, в них образуются абсцессы; в паренхиматозных органах (легкие, пе­чень, селезенка) формируются множественные абсцессы, заболевание сопро­вождается лихорадкой. Морские свинки погибают через 8-10 дней после заражения, золотистые хомяки — через 3-5 дней. У зараженных самцов мо­жет развиваться феномен Штрауса (см. «Сап»). Павших и погибших живот­ных исследуют бактериологически с использованием всех вышеперечислен­ных методов.