Спектрофлуориметры

Кюветы

Спектрофотометры

Электронные спектры поглощения измеряют на спектрофотометрах. Типичный рабочий диапазон для спектрофотометра – 200–900 нм. Принципиальная схема прибора включает следующее. Свет от источника (1) диспергируется монохроматором (2), монохроматический свет проходит через входную щель (3), расщепляется на два луча с помощью светоделительного устройства (4), после фокусировки (5) один из лучей проходит через кювету с образцом (6), а другой через канал сравнения. Прошедшие лучи регистрируются фотоприемником (7), в качестве которого обычно используют фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), реже охлаждаемый фотодиод. Для научных исследований пригодны только приборы, работающие по двухлучевой схеме (с каналом сравнения), т.к. в однолучевых спектрометрах возможен значительный дрейф нулевой линии. Диапазон измерения оптической плотности для двухлучевых приборов – до 2–3 ед.

Высокоточные приборы помимо основного монохроматора имеют также предварительный монохроматор, что позволяет снизить уровень паразитного излучения (рассеянного света). Это позволяет расширить диапазон измерения оптической плотности до 4–5 ед.

В настоящее время широко используются спектрометры, в которых фотоприемником служит фотодиодная матрица. Они характеризуются большой скоростью регистрации спектра. Однако в таких приборах образец облучается белым светом, который затем проходит через монохроматор и регистрируется на фотодиодной матрице. Такие приборы могут не подойти для количественного исследования соединений, которые легко подвергаются фотохимическим превращениям.

Важным элементом в спектрофотометрии, а также в спектрофлуориметрии, являются кварцевые кюветы, в которые помещают растворы исследуемых веществ. Перед экспериментом необходимо знать, как была изготовлена кювета. Кюветы могут изготавливаться путем склеивания, спекания или пайки кварцевых стекол.

Клееные кюветы пригодны далеко не для всех растворителей.

Кюветы, полученные спеканием, могут сорбировать и накапливать вещества в порах в местах спекания, при этом возникают проблемы с удалением сорбированного вещества.

Паяные кюветы лишены большинства недостатков.

Тем не менее, нужно иметь в виду, что некоторые вещества могут сорбироваться из органического растворителя на стенки кварцевых кювет. Сорбция приводит к уменьшению оптической плотности раствора. Для работы с такими веществами необходимо провести гидрофобизацию поверхности кюветы, то есть заменить OH-группы на поверхности кюветы на гидрофобные группы. Типичный способ гидрофобизации это обработка кюветы раствором триметилхлорсилана в толуоле.

При работе с органическими растворителями необходимо, чтобы кварцевая кювета имела хорошо пришлифованную пробку (для предотвращения испарения растворителя в ходе эксперимента).

Принципиальная схема спектрофлуориметра включает следующее. Свет от источника (1, обычно ксеноновая лампа) диспергируется с помощью монохроматора (2) и расщепляется на два луча на светоделителе (3), один луч идет в канал сравнения (4), другой проходит через кювету с образцом (5), испускаемый образцом свет диспергируется монохроматором флуоресценции (6) и поступает на фотоприемник (7, обычно это ФЭУ). Как правило, регистрируется только та часть флуоресценции, которая испускается в направлении, перпендикулярном оси пучка возбуждающего света.

Отличительной особенностью спектрофлуориметрии является то, что регистрируемая спектральная зависимость является функцией двух переменных – длины волны возбуждения l_ex и длины волны испускания l_em. Если l_ex фиксирована, а l_em сканируется, то измеряется спектр флуоресценции I (l_em). Если сканируется l_ex при постоянной l_em, то получается спектр возбуждения флуоресценции I (l_ex), который называют также спектром действия флуоресценции.

Спектрофлуориметрия: практические аспекты

Как уже говорилось, флуоресценция обычно происходит из нулевого колебательного уровня нижнего возбужденного состояния S₁. Поэтому спектр возбуждения флуоресценции, как правило, совпадает со спектром поглощения. Прежде чем измерить спектр флуоресценции вещества, следует вначале получить истинный спектр возбуждения флуоресценции и сравнить его со спектром поглощения. Соответствие этих спектров будет означать, что флуоресцирует исследуемое вещество, а не примеси. Флуориметры, не способные измерять спектры возбуждения, малопригодны для научных исследований.

Чувствительность фотоприемников зависит от длины волны света. Поэтому для получения истинного спектра флуоресценции измеренные зависимости интенсивности от длины волны должны быть исправлены с учетом спектральной чувствительности фотоприемника. Существуют разные способы калибровки фотоприемников, например, можно использовать известные истинные спектры флуоресценции стандартных веществ. Спектры, полученные на разных приборах, можно сопоставлять только в том случае, если вы уверены, что они исправлены с учетом спектральной чувствительности аппаратуры.

Интенсивность возбуждающего света также зависит от длины волны. Для получения истинного спектра возбуждения флуоресценции прибор должен иметь канал сравнения, в который помещают вещество, играющее роль счетчика фотонов.

Эффект внутреннего фильтра. Если оптическая плотность исследуемого образца мала (< 0.1), то интенсивность флуоресценции примерно одинакова в любой точке вдоль пути возбуждающего света через образец. Это оптимальные условия для измерения. При увеличении оптической плотности раствора интенсивность флуоресценции, регистрируемой под прямым углом, вначале растет, затем ее рост замедляется и, наконец, падает, поскольку флуоресцирует только очень тонкий слой вблизи передней стенки кюветы. Это явление называют эффектом внутреннего фильтра.

Вторичное поглощение. Еще один эффект, который может приводить к ошибкам измерения флуоресценции – вторичное поглощение (реабсорбция). Эффект реабсорбции возникает, если спектры поглощения и флуоресценции перекрываются и оптическая плотность образца в области перекрывания значительна. Реабсорбция приводит не только к ошибкам измерения интенсивности флуоресценции, но и к искажению формы спектра флуоресценции. В результате нарушается зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции. Искажения становятся тем больше, чем больше оптическая плотность образца в области перекрывания спектров. Если оптическая плотность образца в области перекрывания не превышает 0.05, то эффектом реабсорбции можно пренебречь.