2015-03-20
1902
Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи. Линейная последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями, определяет первичную структуру белковой молекулы.
ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ
I. Выделение белка из смеси в чистом виде (по одному из признаков: размер молекулы, заряд, специфическое сродство связывания). Определение М.
II. Определение N-концевой АК.
III. Определение С-концевой АК.
IV. Определение АК-последовательности белковой цепи.
Выделение белка из биологического материала основано на его физико-химических свойствах. Чаще всего для этих целей используют кислотно-основные свойства белков (амфотерность, заряд молекулы, изоэлектрическое состояние).
От заряда белковых молекул зависит их:
- растворимость (минимальна в ИЗС);
- электрофоретическая подвижность;
- структура и биологическая активность.
При растворении в водной среде на поверхности белковой молекулы формируется гидратная оболочка.
Устойчивость белка в растворе зависит от:
1) заряда белковой молекуы;
2) наличия гидратной оболочки;
3) молекулярной массы белка.
Для выделения нативных белков (без изменения пространственной структуры) из биологического раствора используют методы:
▪ высаливание (осаждение солями щелочноземельных металлов: хлорид натрия, сульфат аммония); не нарушается первичная структура белка;
▪ осаждение (использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах, около –20°С).
При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.
Денатурация — нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).
МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Отделение белков от низкомолекулярных примесей
Метод мембранных сит (диализ)
Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом белки отмывают от примесей.
Разделение белков по молекулярной массе
