Изменение ферментативной активности ячменя при проращивании

В процессе солодоращения синтезируются или активизируются следующие группы ферментов: протеолитические, цитолитические, амилолитические, липолитические и другие.

Протеолитические ферменты. Роль протеолитических ферментов весьма важна. Продукты гидролиза высокомолекуляных белков ячменя, образующиеся при проращивании зерна и его затирании, во многом определяют вкус, цвет, пенистость готового пива и стойкость его при хранении и служат азотистым питанием для дрожжевых клеток.

В солоде присутствуют две груп­пы протеолитических ферментов: протеиназы и пептидазы. Каж­дая группа, в свою очередь, состоит из большого числа отдельных ферментов. Они наряду с цитолитическими ферментами принимают уча­стие в разрушении стенок клеток эндосперма.

Протеиназы ращепляют преимущественно внутренние пептидные связи в молекулах белков и отсюда их второе название - эндопептидазы.

Эндопептидазы (протеиназы) присутствуют в исходном ячмене, и их активность при проращивании резко повышается, что обусловлено накоплением в зародыше значительного количество глютатиона.

В ячменном зерне содержатся протеиназы, максимальная активность которых проявляется при различных рН: 3,8; 6,3 и 8,6; отсюда и деление протеиназ на к и с л ы е, н е й т р а л ь ­н ы е и щ е л о ч н ы е.

Наибольшей активностью обладают кислые протеиназы яч­меня, имеющие в своем активном центре сульфгидрильную группу. При солодоращении актив­ность кислойпротеиназы повышается в 15,5 раза в течение первых 3 суток ращения.

Протеолитические ферменты, гидролизующие концевые наружные связи в молекулах белков, носят название пептидаз. Пептидазы делятся на три группы:

- аминопептидазы;

- карбоксипептидазы;

- дипептидазы.

Аминопептидазы отщепляют концевую кислоту, содержащую свободную аминогруппу, карбоксипептидаза отщепляет концевую аминокислоту, содержащую свободную карбоксильную группу. Дипептидазы разлагают дипептиды на свободные аминокислоты.

Все пептидазы обладают большой специфичностью. Пептидазы содержатся в покоящемся ячмене, но до проращивания активности не проявляют. Пептидазная активность выявляется позже протеиназной и максимально проявляется на 5 сутки проращивания, увеличиваясь в 4 раза.

Цитолитические ферменты. В процессе разрыхления зерна ячменя при солодоращении, т.е. перехода твердого состояния мучнистого тела эндосперма в рыхлое (когда он может быть легко растерт между пальцами), наряду с протеолитическими значительную роль играют цитолитические ферменты. Объектом воздействия этих ферментов являются вещества клеточных стенок эндосперма: целлюлоза, гемицеллюлоза, пентозаны (ксилан, арабан, арабаноксилан), гумми-вещества, т.е. некрахмалистые полисахариды.

Каждый тип некрахмалистого полисахарида имеет свою группу действующих на него цитаз.

Главная составная часть гемицеллюлоз ячменя – β-глюкан.

Эндо-β-глюканаза действует на β-1,3 и β-1,4 связи β-глюкана, причем превалирует разрыв β-1,3 связей.

Экзо-β-глюканаза разрывает преимущественно β-1,4 связи и является причиной освобождения редуцирующих групп из β-глюконовой цепи. В этом отношении можно отметить аналогию с действием α-амилазы на цепь амилозы.

Эндо-β-глюканазы в покоящемся зерне не содержатся либо присутствуют в незначительных количествах. Они образуются в алейроновом слое с участием гиббереллинов.

Экзо-β-глюканаза в покоящемся зерне присутствует, но активизироваться начинает только при образовании предыдущего фермента.

Максимальная активность β-глюканаз достигается на 5-8-й день проращивания и возрастает в 140 раз.

В процессе солодоращения также резко увеличивает­ся активность целлобиазы (действует на β-1,4-связь в дисахаридах (целлобиозе)) более чем в 100 раз.

В меньшем количестве, чем гемицеллюлоза и гумми-вещества, в клеточных стенках эндосперма находятся пентозаны: ксилан, арабан, арабиноксилан и т. д. В их превращениях участвуют четыре фермента.

Арабинозидаза освобождает боковые цепи высокомолекулярно­го арабиноксилана по связи β-1,2 или β-1,3, в результате образуются олигосахариды.

Эндоксиланаза расщепляет линейные цепи арабиноксилана по β-1,3, β-1,4-связям до декстринов, независимо от нахождения раз­ветвлений.

Экзоксиланаза действует на линейные цепи, обязательно с нере­дуцирующего конца, образует ксилобиозу (после удаления от моле­кул арабиноксиланов ответвлений арабинозы).

Ксилобиаза гидролизует ксилобиозу и ксилотриозу до ксилозы.

Эти ферменты, как и β-глюканазы, действуют ступенчато, гидролизуя пентозаны до моносахаридов.

В зерне ячменя активность ферментов, гидролизующих пентоза­ны, невелика. В процессе солодоращения она увеличивается, но в гораздо меньшей степени, чем активность ферментов, действую­щих на гемицеллюлозу (примерно в 3 раза), проявляя свою активность на четвертый день проращивания.

Ферментативный гидролиз некрахмалистых полисахаридов яч­меня в процессе солодоращения имеет огромное практическое зна­чение.При этом гидролизе стенки клеток эндосперма растворяют­ся и образовавшиеся в солоде амилазы и протеазы при затирании сырья свободно проникают в их содержимое, гидролизуя крахмал и белок. Гидролиз при проращивании водорастворимых некрахмали­стых полисахаридов, в частности β-глюкана, приводит к снижению вязкости сусла, что положительно влияет на фильтрование сусла и пива, а также на осветление пива при выдержке.

Амилолитические ферменты. Для максимального извлечения экстрактивных веществ из ячменя и солода необходимо присутствие амилолитических ферментов в солоде.

Амилазы солода представлены следующими ферментами: α- и β-амилазы, которые различаются механизмами своего действия на крахмал.

Фермент стабилен при рН 5 - 9, а оптимум рН 5 - 6. α-амилаза име­ет самый высокий для ферментов солода температурный оптимум (70 °С). Это еще одно существенное отличие а-амилазы от β-амилазы, которая в таких температурных условиях необратимо инактивиру­ется.

α-амилаза является типичным компонен­том солода и активируется только при прорастании ячменя. α-амилазную активность можно обнаружить в ячмене лишь после длительного хранения его и в очень небольших количествах. Накопление α-амилазы активно происходит до четвертого дня ращения зерна, а затем ее содержание медленно возрастает до своего максимума в конце проращивания.

β-амилаза имеет температурный оптимум в области 60 °С, рН – оптимум 4,5 – 5,0. Она содержится в непроросшем ячмене в дос­таточном количестве и находится в связанной форме. Предполагают, что фермент связан дисульфидными связями с нерастворимым протеином. По мере прорастания зерна дисульфидные мостики разрушаются, и β-амилаза выходит из неак­тивного состояния. Если для накопления α-амилазы в достаточ­ных для затирания количествах требуется полный цикл солодоращения, то β-амилаза в основном накапливается за 4 - 6 сут.

В солоде найден еще один фермент, действующий на крахмал, — олиго-1,6-глюкозидаза (предельная декстриназа). Предельные дек­стрины, которые образуются при действии α- и β-амилаз на амилопектин и ими не расщепляются, гидролизуются этим ферментом. Он расщепляет α-1,6-глюкозидные связи и превращает предельные декстрины в мальтозу, мальтотриозу, мальтотетраозу, в результате чего повышается конечная степень сбраживания сусла. Наиболь­шую активность фермент проявляет на 6-й день проращивания. Свойства фермента: температурный оптимум 40 ° С, инактивируется при 65 °С, рН-оптимум 5,1.

В ячмене и солоде обнаружены такие ферменты как мальтаза (α-глюкозидаза), β -фруктофуранозидаза (инвертаза).

Эстеразы солода. К эстеразам солода относятся липазы и фосфатазы. Субстратами для их действия являются соответственно липиды и фосфорнокислые эфиры жирных кислот – фосфолипиды.

Наиболее изученный фермент из этой группы - собственно ли­паза (гидролаза эфиров глицерина). Свойства фермента: рН-оптимум 6,8, температурный оптимум 45 - 48 °С. Липаза содержится в покоящемся зерне, при прорастании ячменя активность липазы удваивается.

Второй фермент, принимающий участие в видоизменении жи­ров ячменя, - липоксигеназа. Он стабилизирует самоокисление жирных кислот и атакует, главным образом, ненасыщенные жирные кислоты с несколькими двойными связями: линолевую, линоленовую и арахиновую. Липоксигеназа повреждает в основном храня­щийся ячмень. Прогорклый вкус зерна, появляющийся при непра­вильном температурном режиме хранения и предварительной суш­ке ячменя, объясняется действием липоксигеназы.

Третья группа эстераз ячменя и солода - фосфолипазы. Эти ферменты относятся к классу эстераз, катализирующих расщепле­ние фосфатидов - лецитина и кефалина.

При солодоращении содержание жира в ячмене уменьшается на 12 - 40 %.

При проращивании ячменя и затирании зернопродуктов боль­шое значение имеют также фосфоэстеразы, или фосфатазы, катали­зирующие гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты.

Ферментативное отщепление фосфорной кислоты на различных стадиях получения солода и пива технологически очень важно из-за ее непосредственного влияния на кислотность и буферную систему сусла и пива.

Важной солодовой фосфоэстеразой является фитаза (мезаино-зитгексафосфатфосфогидролаза). Она очень активна и от фитина постепенно отщепляет фосфорную кислоту. При этом образуются различные фосфорные сложные эфиры инозита, а в конце гидроли­за - инозит и неорганический фосфат.

Оптимальный рН солодовых фосфатаз находится в относитель­но узком диапазоне - от 4,5 до 5,5. Их оптимальный температур­ный интервал 40-50°С очень близок к температурному интервалу действия пептидаз (протеаз). Фосфатазы содержатся в покоящемся ячмене, при прорастании их количество увеличивается в 5 - 6 раз, достигая максимума на 2 - 5-й день.

Количество фосфатов в солоде увеличено вдвое по отношению к ячменю. Степень расщепления фосфатов определяет титруемую кислотность сусла и его буферность.

Определенное технологическое значение имеют оксидоредуктазы. В ячмене в небольшом количестве содержится каталаза, при проращивании ее активность возрастает в 40 - 70 раз.

Активность пероксидазы при проращивании увеличивается в 7 - 9 раз.

В ячмене относительно высокую активность проявляет полифе-нолоксидаза, которая активируется вдвое при проращивании.