Вопросы

1. Что такое предметные и покровные стёкла? Для чего они используются?

2. Как приготовить препарат «раздавленная капля»?

3. Как приготовить препарат «висячая капля»?

4. Как приготовить фиксированный препарат?

5. Как окрасить препарат по Граму?

6. Задачи прижизненной микроскопии микробов. Каковы преимущества и недостатки этого метода?

7. Какова форма клеток у бактерий?

8. Какие группировки клеток бывают у шаровидных бактерий и как они называются?

9. Каково значение спор у бактерий?

10. Какими свойствами обладают споры?

11. За счёт чего бактерии активно двигаются?

12. Как называются бактерии с разным числом жгутиков?

13. Как приготовить препарат плесневых грибов?

14. Как размножаются грибы?

15. Какой формы бывают клетки дрожжей?

16. Как размножаются дрожжи?

17. Как выявить в клетках дрожжей гликоген, волютин, жир?

Внутренняя организация микроорганизмов

Лабораторная работа № 5

Определение ферментов микроорганизмов. Физиология микроорганизмов занимает одно из центральных мест в микробиологии. Она изучает вопросы питания микроорганизмов, конструктивный и энергетический обмен, ферменты, рост и их размножение. Решение этих вопросов дает представление о взаимосвязи структуры и функции клеток, закономерностях их жизнедеятельности.

Подсчитано, что хромосома Е. coli (прокариотной клетки) может нести код для 3000 различных белков. Клетки эукариотов, например Saccharomyces cerevisiae, приблизительно в 4 раза больше. Проведено примерное определение числа ферментов, участвующих в клеточном метаболизме. Это число неодинаково у разных микроорганизмов, но в синтезе низкомолекулярных соединений у микроорга­низмов вовлекается примерно 600-800 ферментов, 200-300 ферментов требуется для метаболизма полимеров.

В лабораторной работе необходимо определить внеклеточные (экзо) ферменты. Это одна из самых малоизученных проблем. Действительно, каким образом большие белковые молекулы, которые обычно не могут проникать через цитоплазматическую мембрану микроорганизмов, выходят из клетки, не вызывая при этом изменений в клеточной структуре. Оказалось, что экзоферменты - необычная группа белков: они имеют низкий молекулярный вес, содержат (или вовсе не содержат) остатки цистенна, которые придают прочность белковой молекуле и делают их более гибкими. Есть предположение, что синтез экзоферментов происходит на наружной поверхности цитоплазматической мембраны, а затем свободно диффундирует через клеточную стенку в окружающую среду.

Знание физиологических процессов и их особенностей у разных микроорганизмов помогает в решении таких проблем, как культивирование, в том числе и промышленное, для получения биологически активных веществ, аминокислот, ферментов, антибиотиков и др.; идентификация микроорганизмов при биоповреждениях промышленных товаров и при порче пищевых продуктов (определение их безопасности).

В основе метаболических реакций, протекающих в клетке микроорганизмов, лежит деятельность ферментов - самого крупного высокоспециализированного класса белков.

Ферменты являются биокатализаторами исключительной эффективности и высокой специфичности. Все вопросы строения ферментов, механизма каталитического действия и другие изучаются в курсе биохимии.

Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 известным классам: оксидоредуктазам, трансферазам, лиазам, гидролазам, изомеразам и лигазам.

Ферментный состав любого микроорганизма — это достаточно постоянный признак. Поэтому определение ферментов, особенно у бактерий, имеет важное значение при дифференциации и идентификации микроорганизмов. Многие ферменты выделяются клеткой в окружающую среду, их называют экзоферментами. Они расщепляют макромолекулы во внешней среде до более простых веществ, способных проникнуть в клетку.

Функциональная активность ферментов и скорость реакции во многом зависят от внешних условий, в которых находится данный микроорганизм.

Ферменты микроорганизмов, синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке всегда в постоянных концентрациях, называются конститутивными. Ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия субстрата, называются индуцибельньши. Для определения ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, производят посев чистой культуры в ряд питательных сред определенного состава. После термостатирования посева в течение 2-3 суток, а иногда и более, производят анализ происшедших изменений в питательных средах. По изменениям делают выводы о наличии тех или иных ферментов, вырабатываемых данным микроорганизмом.

Образование протеолитических ферментов. Действие микроорганизмов на белки обусловливается наличием в них протеолитических ферментов - протеаз. Протеолитические ферменты делятся на протеиназы, пептидазы и дезаминазы. Протеиназы расщепляют натуральный белок до пептонов, пептидов и аминокислот. Пептидазы расщепляют пептиды до аминокислот, а дезаминазы вызывают распад амидов и аминокислот с выделением азота в виде мочевины или аммиака. Серосодержащие аминокислоты расщепляются с выделением сероводорода. В процессе гниения (распад белка) в окружающей среде накапливаются разнообразные продукты, обладающие неприятным запахом.

Таким образом, от состава протеолитических ферментов, вырабатываемых микроорганизмами, зависит глубина распада белковой среды и степень ее минерализации.

Для выявления протеолитических ферментов чистую культуру микроорганизмов вносят в пробирку с мясо-пептонным бульоном. Для выявления дезаминаз и других ферментов распада аминокислот в пробирку подвешивают фильтровальную бумагу, смоченную уксуснокислым свинцом, и влажную лакмусовую бумагу. При анализе роста микробов в бульоне опытную пробирку нельзя встряхивать. Рост определяется по наличию роста микроорганизмов.

Полоска лакмусовой бумаги, смоченная уксуснокислым свинцом, улавливает сероводород, при этом происходит почернение её из-за образования сернистого свинца. Посинение лакмусовой бумаги свидетельствует о выделении аммиака и наличии ферментов дезаминаз, осуществляющих расщепление аминокислот. Выделение сероводорода и аммиака указывает на глубокий распад белка под влиянием ферментов микроорганизмов.

Отсутствие этих показателей (при наличии роста культуры) говорит о том, что исследуемый микроорганизм способен разлагать белки, но не выделяет ферментов, расщепляющих аминокислоты.

Некоторые микроорганизмы образуют из триптофана индол. Пробирки со стерильным мясо-пептонным бульоном (8-10 мл) и 0,01%-ным триптофаном (или без него) засевают исследуемыми клетками. Через 5-7 суток в пробирку с культурой вносят 2-3 мл эфира, перемешивают и по стенке осторожно добавляют 1-2 мл реактива Эрлиха. Индол окрашивает эфирный слой в розовый или красный цвет. Параллельно проводят качественную реакцию на индол в стерильной среде. Для определения индола применяют способ Мореля: полоску фильтровальной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой, укрепляют под пробкой. При образовании индола нижняя часть бумаги окрашивается в розовый цвет.

Использование микроорганизмами серосодержащих аминокислот определяют реакцией на выделенный сероводород. После засева изучаемой культуры в пробирки с мясо-пептонным бульоном под пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором ацетата свинца. Пробирки помещают в термостат на 7-10 суток. Выделение сероводорода обнаруживают по почернению нижней части полоски вследствие образования сернистого свинца. Результаты исследований записывают в табл. 9.

Таблица 9

Образование аммиака, индола и сероводорода бактериями

№ п/п	Выявляемые признаки	Образование
аммиака	индола	сероводорода
	Лакмусовая бумага	+	+	+
	Фильтровальная бумага со щавелевой кислотой	+	+	+
	Фильтровальная бумага с ацетатом свинца	+	+	+

Вывод (пример): из трех исследованных культур все образуют аммиак, индол и сероводород, т. е. протеолитические ферменты.

Рост микроорганизмов в желатине. Для выявления у микроорганизмов фермента группы протеиназ (желатиназы) в столбик мясо-пептонного желатина уколом до дна пробирки вносят микроорганизмы. После термостатирования посева при 22^оС в течение 2—3 дней наблюдают их рост. Если микроорганизмы не обладают желатиназой - ферментом, вызывающим гидролиз желатина, то последний остается неразжиженным. Разжижение желатина указывает на то, что данный микроорганизм вырабатывает желатиназу. Причем разжиженный желатин теряет, способность вновь отвердевать. Разные микроорганизмы по-разному его видоизменяют. Одни разжижают быстро, другие — медленно. Разжижение бывает послойное, воронкообразное, кратеровидное, реповидное, мешкообразное, пузыревидное, свойственное анаэробным формам, и др. (рис. 12). Результаты заносят в табл. 10.

Таблица 10

Разжижение желатина бактериями

Номер культуры	Характер разжижения (см. рис. 9 - образец)	Образование протеолитического фермента
	-	+
	-	+
	-	-

Вывод (пример): из трех исследованных культур ни одна не образует желатиназу.

Рис.12. Формы разжижения желатина бактериями

Определение ферментов, разлагающих углеводы. Для выявления у микроорганизмов ферментов группы карбогидраз, вызывающих гидролиз поли- и дисахаридов, глюкозидов, а также для определения бродильных качеств микроба производят посев чистой культуры в среды, содержащие различные сахара, приготовленные на пептонном полутвердом агаре с индикаторной краской ("цветной ряд" сред).

Посев культуры осуществляют уколом бактериологической иглой до дна пробирки со средой. Посевы помещают в термостат при температуре 25-30°С на 1-3 суток и наблюдают изменения среды. Сначала проявляются карбогидразы, которые гидролизуют дисахара в моносахара. Затем действуют ферменты углеводного обмена и окислительно-восстановительные, осуществляющие процесс брожения.

Усвоение микроорганизмом сахара можно наблюдать по накоплению в среде кислотных и газообразных продуктов брожения. Наличие кислот определяют по изменению окраски среды в розовую и красную (индикаторная краска среды). Образование газообразных продуктов выражается появлением в толще среды "глазков". Если после роста культуры, например в сахарозе, было отмечено образование кислоты и газа, следовательно, микроорганизм вырабатывает фермент группы карбогидраз — сахарозу, под влиянием которого сахароза расщепляется в глюкозу и фруктозу. Последние под влиянием ферментов окислительно-восстановительных и углеводного обмена образуют различные продукты брожения.

Если после термостатирования посева среда не подверглась изменениям, значит, у микроорганизма нет ферментов, расщепляющих данный углевод или спирт. Результаты записывают в табл. 12.

Таблица 12

Образование ферментов бактериями при росте на углеводах

Номер культуры	Углеводы
сахароза	Лактоза	глюкоза
газ	кислота	газ	Кислота	газ	кислота
	+	+	+	+	+	+
	-	-	+	+	-	-
	-	-	+	+	-	-

Перечислите, какие ферменты образуют бактерии.