Определение в крови резус-фактора

Определение в крови резус-фактора производится врачами, прошед­шими специальную подготовку на СПК и получившими сертификат.

Резус-фактор определяется с помощью стандартной сыворотки, в ко­торой содержатся активные резус-антитела. Эта сыворотка готовится из крови лиц, сенсибилизированных к резус-фактору, это:

• резус-отрицательные женщины, сенсибилизированные к резус-фактору резус-положительным плодом во время беременности;

• доноры, у которых в крови обнаружены резус-антитела;

• лица, специально иммунизированные резус-антигеном;

• лица, перенесшие трансфузионные реакции или осложнения в связи с резус-конфликтом, в крови которых могут содержаться активные резус- антитела.

Готовая антирезусная сыворотка выпускается в ампулах или флако­нах по 2-5 мл с наклеенными этикетками, на которых указано учреждение - изготовитель, номер серии, обозначена группа по системе AB0, специфич­ность, форма резус-антител и срок годности. На этикетках, по диагонали, наносят те же цветные полосы, что и на стандартных гемагглютинирующих сыворотках.

Сывороткой антирезус 0(I) группы определяют резус-фактор только в эритроцитах первой группы, сывороткой антирезус А(II) группы - в эритроцитах первой и второй групп, а сывороткой антирезус В (III) группы в эритроцитах первой и третьей группах крови. Сывороткой антирезус группы АВ(IV), специально приготовленной (универсальной), определяют резус-фактор в эритроцитах группы АВ(IV) и в других группах крови по системе AB0.

При каждом исследовании на резусную принадлежность необходимо ставить контроль для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус. Для контроля применяют стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты первой или той же группы, что и иссле­дуемая кровь.

Кровь для исследования берут, в количестве 5 мл, в обычную про­бирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы, группу крови лица, у которого взята кровь, отделение и дату. После свер­тывания крови на дне образуется сгусток из эритроцитов, которые и следу­ет брать для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сгусток для отделения большего их количества.

Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого на­трия (0,25 мл на 1 мл крови), но в этом случае необходимо отмыть эритро­циты. Для этого в пробирку доверху наливают изотонический раствор хло­ристого натрия, хорошо перемешивают и центрифугируют. Отмытые эрит­роциты берут для исследования.

Стандартные антирезусные сыворотки активны только в определен­ных условиях, поэтому методика определения резус-фактора этими сыво­ротками указывается в сопроводительной инструкции. Резус-фактор в крови можно определять следую­щими способами:

• с помощью универсального реагента в пробирках без подогрева;

• реакцией с применением 10% желатина в пробирках с подогревом (+46- 48°С);

• реакцией агглютинации в солевой среде;

• с помощью цоликлона анти-Д Супер.

На практике чаще пользуются первым способом. Стандартный уни­версальный реагент представляет собой смесь сыворотки АВ(IV) группы крови и 33% раствора полиглюкина в соотношении 2:1. Его приготавлива­ют на СПК. Универсальный реагент не содержит групповых агглютининов (в сыворотке АВ(IV) группы крови их нет), поэтому он может быть ис­пользован для определения резус-антигена Д в эритроцитах любой группы крови системы AB0. Исследованию может подвергаться кровь, взятая из пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке с кро­вью, взятой без стабилизатора, но после образования сгустка.

Методика проведения реакции:

1. В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объе­мом до 10 мл, по количеству образцов эритроцитов. Дополнительно уста­навливают еще две пробирки, для контроля реакции с резус- положительными и резус-отрицательными эритроцитами. Попарно, из первого и второго ряда пробирок, производят надписи фамилии и инициа­лов лиц, у которых исследуют кровь.

2. Во все пробирки первого ряда и в две контрольные пробирки вно­сят по две капли стандартного универсального реагента-антирезус; во все пробирки второго ряда вносят по две капли изотонического раствора хло­ристого натрия и по одной капле 33% раствора полиглюкина;

3. В пробирки первого и второго ряда вносят по одной капле иссле­дуемых эритроцитов; в первую контрольную пробирку вносят одну каплю стандартных резус-положительных эритроцитов, во вторую контрольную пробирку - такую же каплю стандартных резус-отрицательных эритроци­тов.

4. Пробирки встряхивают, затем медленно поворачивают по оси, на­клоняя почти до горизонтального уровня, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки, что делает реакцию более выраженной.

Оценка результатов исследования:

Агглютинация может появиться уже на первой минуте, но ожидать необходимо три минуты, так как реакция может быть замедленной. Через три минуты в пробирки наливают по 2-3 мл изотонического раствора хло­ристого натрия, перемешивают двух - трехкратным плавным переворачи­ванием пробирок (не встряхивать!). Пробирки просматривают на свет не­вооруженным глазом или через лупу, выявляя наличие или отсутствие агг­лютинации эритроцитов. Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой антирезус, считаются резус-положительными, а не давшие агг­лютинации - резус-отрицательными.

В контрольных пробирках должна произойти аналогичная реакция - отсутствие агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритро­цитами и наличие ее со стандартными резус-положительными эритроци­тами. В пробирках второго ряда агглютинации быть не должно. Наличие агглютинации указывает на возможность ее появления за счет аутоантител. В таких случаях следует повторить реакцию с эритроцитами, отмытыми в теплом изотоническом растворе хлористого натрия, для удаления с них ау­тоантител. При сомнительном результате определения резус- принадлежности, следует применить метод агглютинации в солевой среде с использованием сыворотки антирезус, содержащей полные антитела, или провести исследование с цоликлонами анти-Д Супер.

Определение резус-принадлежности крови только по сыворотке анти-Д считается недостаточным. В случаях резус-отрицательной реакции необходимо дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных засчитываются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов. Это особенно важно при обследовании доноров, беременных женщин с подоз­рением на изосенсибилизацию и некоторых других категорий больных.

Реакция агглютинации на плоскости

с помощью цоликлонов анти-D супер

1. Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

2. Наносят рядом маленькую каплю (0,02-0,03 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой.

3. Через 10-20 секунд мягко покачивают пластинку.

4. Результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания, несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 секунд.

5. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус положительная, при отсутствии - как резус отрицательная.

6. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом на плоскости при комнатной температуре могут быть использованы поликлональные сыворотки анти-D с неполными антителами, приготовленные в комбинации с коллоидами (альбумином, полиглюкином).

Цоликлон анти-D супер выпускается во флаконах по 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холо­дильнике при t 2~8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в хо­лодильнике в течение месяца в закрытом виде.