Лабораторная работа № 6. Тема: Кинетика ферментативных реакций Регуляция активности ферментов Цель работы: - Овладение методами кинетики

Оборудование и материалы:

· Спектрофотометр SOLAR

· Кюветы стеклянные

· Термостат

· Пробирки

· Штативы для пробирок

· Колбы на 100-250мл

· Стакан на 300 мл

· Автоматические микропипетки

· палочки стеклянные

· Бумага миллиметровая

Реактивы:

· Амилаза бактериальная

· Крахмал, 0.25% раствор

· Раствор Люголя (йод, 1% раствор в KJ, 2,5%)

· Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

· Хлорид натрия (NaCl), 1% раствор

· Натрий-фосфатный буфер, 0,1 М рН 7,40

· Мембраны эритроцитов

· Ацетилтиохолин, 1мМ раствор в натрий-фосфатном буфере

· Ацетилхолин, 5мМ раствор в натрий-фосфатном буфере

· Реактив Эллмана

· Вода дистиллированная

Теоретическая часть

Влияние концентрации субстрата на активность фермента

Начальная скоро­сть ферментативной реакции, обозначаемая символом V_о (скорость, измеряемая за период, когда израсхо­дована небольшая доля субстрата) увеличивается по мере роста концентрации субстрата [S] в реакционной смеси. При неизменности остальных условий реакции (концентрации фермента [Е], концентрации кофакторов, температуры) скорость превращения субстрата в продукт увеличивается до определенного значения, называемого максимальной скоростью реакции, V _max, которая далее остается постоянной.

Рис. 6.1 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Начальная ско­рость ферментативной реакции, V_о, увеличивается с ростом концентрации субстрата до тех пор, пока не наступит состояние на­сыщения фермента субстратом. Начальная скорость, измеренная в условиях насыщения, уже не зависит от дальнейшего повышения концентрации субстрата. В ферментативной кинетике обычно используют значительный молярный избыток субстрата по сравнению с концентрацией фермента. Например, если фермент с молекулярной массой 100.000 взаимодействует с субстратом с молекулярной массой 100 и оба компонента присутствуют в реакционной смеси в концентрации 1 мг/мл, каждый, то на один моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. В клетке наиболее реальными являются сле­дующие численные значения концентраций фермента и субстрата: [E] = 0,1 мкг/мл = 10 ^{– 9} М, [S] = 0,1 мг/мл = 10 ^{– 3} М, т.е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет 10⁶. Даже при уменьшении [S] в 100 раз, его концен­трация все еще будет 10.000-кратно превышать концентрацию фермента.

Точкам А, В и С на графике, изображенном на рис. 6.1, соответствуют ситуации А, В и С, приведенные на рис. 6.2.

Рис. 6.2 Схема, поясняющая взаимодействие субстрата с ферментом при низкой (А) и высокой (С) концентрации субстрата, а также при концентрации субстрата, равной величине K_m (В). Состояния А, В и С соответствуют точкам А, В и С, указанным на кривой рис. 6.1.

Несмотря на то, что молекул субстрата в реакционной смеси на­много больше, чем молекул фермента, в точках А и В (рис. 6.1) в связывании субстрата принимает участие небольшая часть молекул фермента. Это происхо­дит по той причине, что константа равновесия реакции взаимодействия субстрата с ферментом E + S «ES (т.е. образование фермент-субстратного комплекса ES) хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках А и В повышение или понижение [S] будет приводить к увеличению или уменьшению доли молекул E, связанных с S (т. е. доли комплексов ES), и V_о будет зависеть от [S]. В точке С на графике (рис. 6.1) практически все молекулы фермента связаны с субстратом. Поэтому, несмотря на повышение частоты столкновений молекул E и S, дальнейшее увеличение [S] не приведет к росту скорости реак­ции – в реакционной смеси будут отсутствовать молекулы фермента, которые были бы свободны для связывания субстра­том.

Случай В представляет особый теоретический ин­терес. Поскольку при этом ровно половина молекул фермента насыщена субстратом (рис. 6.2) - начальная скорость реакции будет составлять величину, равную половине максимальной скорости (1/2V _max), которая может быть достигнута при данной концентрации фер­мента.