Уравнение Михаэлиса–Ментен

Важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции, является концентрация реагирующих веществ, концентрация субстратов. Как было указано выше, фермент взаимодействует с субстратом. Затем фермент-субстратный комплекс распадается с образованием продукта реакции, а катализатор остается в первоначальном состоянии. Ниже приведено уравнение, отражающее процесс ферментативного катализа с образованием продукта реакции:

Как видно из этого уравнения, фермент Е взаимодействует с субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Константа скорости прямой реакции – k₊₁, а константа обратной – k_-1. Константа скорости распада комплекса ES с образованием продукта – k₊₂. Поскольку комплекс ES способен диссоциировать, можно записать выражение равновесной константы диссоциации комплекса, K_S, которая равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакций:

Исходя из закона действующих масс, можно записать: скорость реакции образования комплекса ES v = k₊₁ [E][S], а скорость распада комплекса v = k_-1 [ES]. При равенстве этих скоростей получим выражение: k₊₁ [E][S] = k_-1 [ES]. Разделив обе части уравнения на величину k₊₁, получим: [E][S] = k_-1 / k₊₁ [ES], где k_-1 / k₊₁ представляет собой K_S. Таким образом, после приведенного преобразования выражение приобретает вид: [E][S] = K_S[ES]. В этом уравнении величину [E] можно записать как [E₀] – [ES], что представляет собой концентрацию свободного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом. [E₀] – это общая концентрация фермента в начале реакции.

После преобразования последнего уравнения получаем:

Максимальная скорость ферментативной реакции достигается в ситуации, когда концентрация комплекса ES равна начальной концентрации фермента Е₀ т.е. [ES] = [E₀]. Таким образом, можно записать следующую зависимость:

Поскольку из предыдущего выражения следует, что:

то получаем:

Это последнее уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. Графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции отображает рис. 6.1. Из этого рисунка видно, что при низких концентрациях субстрата реакция характеризуется первым порядком, а при его высоких концентрациях становится реакцией нулевого порядка, когда скорость реакции становится постоянной величиной.

Следует, однако, помнить, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо только для начального времени реакции, когда присутствует избыток субстрата и образуется небольшое количество продукта. Именно поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен носит несколько ограниченный характер, поскольку оно учитывает только первую часть процесса и не учитывает его вторую стадию - влияние продукта реакции и его взаимодействие с ферментом. В связи с этим Холдейном и Бриггсом было предложено усовершенствованное выражение уравнения Михаэлиса-Ментен:

где К _m – константа Михаэлиса, которая равна концентрации субстрата (выраженной в молях/литр), при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Численное значение константы Михаэлиса может быть выражено следующим образом:

Преобразованное Холдейном и Бриггсом уравнение Михаэлиса–Ментен, которое имеет выражение

описывает поведение многих ферментов при измене­нии концентрации их субстратов. Используя это урав­нение можно рассмотреть несколько ситуаций, отражающих влияние [S] и К _m на начальную скорость фермента­тивной реакции:

1. Значение [S]намногоменьше величины К _m (точка А на рис. 6.1 и 6.2). В этом случае величину [S] в знаменателе можно опу­стить, и он будет практически равен величине К _m. Отношение двух постоянных величин - V _max и К _m, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

;

(@ означает «примерно равно»).

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже величины К_m - начальная скорость реакции, V_о, пропорциональна концентрации субстрата [S];

2. Значение [S]намногобольше величины К _m (точка С на рис. 6.1 и 6.2). Тогда величиной К _m в знаменателе можно пренебречь, т.е.

;

Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей К_m, начальная скорость V_о рав­на максимальной скорости - V_max;

3. Наконец, при равенстве величин [S] и К _m (точка В на рис. 6.1 и 6.2) в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен получим удвоенное значение [S].

;

Это означает, что при концентрации субстрата, равной К_m, начальная скорость реакции V_о составляет половину максимальной скорости - V_max.

Графическое определение константы Михаэлиса (К _m)

Графически константа Михаэлиса может быть представлена, как это показано на рис. 6.1. Однако в случае многих ферментов определение V _max и К _m непосредственно из графика зависимости V_о от [S] (рис. 6.1) оказывается затруднено. Для большего удобства уравнение Михаэлиса–Ментен было преобразовано Лайнуивером и Берком в координатах двойных обратных величин:

Правую часть уравнения представляют в виде суммы двух слагаемых:

Упростив уравнение, получаем:

Как можно видеть, это уравнение представляет собой уравнение прямой:

у = ах + b,

где у = 1/V_о и х = 1/[S].

Если построить график зависимости у (т.е. 1/V_о) от х (т.е. 1/[S]), то длина отрезка b, отсекаемого на оси у, будет равна 1/V _max, а тангенс угла наклона – а равен величине K _m /V _max. Длину отрезка, отсекаемого на оси х (в области отрицательных значений), можно получить, приравняв к нулю. Тогда получим:

График уравнения Михаэлиса–Ментен в обрат­ных координатах называют графиком Лайнуивера–Берка (рис. 6.3). Используя его, величину K _m можно определить либо по наклону прямой и длине отрезка, отсекае­мого на оси у, либо по длине отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений на оси х. Поско­льку [S] измеряют в молях/литр, K _m имеет ту же размерность. Скорость V_о мо­жет быть выражена в любых единицах, поскольку K _m не зависит от [E]. ГрафикЛайнуивера–Берка позволяет определять K _m по отно­сительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра.

Рис. 6.3 График Лайнуивера–Берка в двойных обратных координатах (зависимость 1/V_о от 1/[S]), используемый для графического определения K_m и V _max.

Используя график Лайнуивера–Берка на прак­тике, при определении K _m, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких кон­центраций субстрата. Это происходит в тех случаях, когда измерения проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует прово­дить при таких значениях [S], которые соответ­ствуют равным интервалам на оси х в обратных ве­личинах.

Определение K _m имеет большую практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих K _m, фермент будет работать практически с макси­мальной скоростью, поэтому максимальная скорость, V _max, будет отражать количество присутствующе­го активного фермента. Это немаловажное обстояте­льство используют для оценки содержания фермен­та в препарате. Знание величины K _m позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения V _max. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое примене­ние при анализе характера действия ингибиторов на ферментативные реакции.