Биохимический метод.

Основы медицинской генетики. Человек как объект генетических исследований. Задачи, принципы и методы медико-генетического консультирования

Генетика человека изучает явления наследственности и изменчивости в популяциях людей, особенности наследования нормальных и патологических признаков, влияние генетической конституции на возникновение и развитие заболеваний. Объектом медицинской генетики является человек. Человек представляет собой довольно сложный объект генетических исследований. Это связано прежде всего с особенностями его генетический организации.

У человека большие размеры:

- генома (около 3*10⁹ пар нуклеотидов в гаплоидном наборе);

- много полигенных и мультифакториальных признаков;

- сложный характер экспрессии нормальных и патологических признаков, что затрудняет процесс идентификации их генов;

- невозможность использования классического гибридологического метода, основанного на экспериментальных скрещиваниях разных организмов с последующим анализом полученного потомства, и многое другое.

Несмотря на эти особенности человек является одним из наиболее изученных генетических объектов. Отсутствие экспериментальных скрещиваний компенсируется возможностью анализировать большое число семей и выявлять характер наследования интересующих признаков. Успешно развиваются методы гибридизации культивируемых соматических клеток человека, клонирование генов человека, что позволяет проводить генетический анализ клеток человека.

Проводится огромная работа по генетическому картированию всех хромосом человека. В рамках завершающихся исследований по международной программе «Геном человека» совместными усилиями ученых разных стран составлены генетические карты хромосом, содержащие в сумме около 32 тысяч генных локусов. Успешное применение методов биохимии, физиологии, морфологии, а также интенсивное развитие методов ДНК – диагностики позволяет быстро и эффективно диагностировать различные формы наследственной патологии человека.

Биохимический метод.

Биохимический метод является основным в диагностике многих моногенных болезней, приводящих к нарушению обмена веществ. Объектами биохимической диагностики являются биологические жидкости: кровь, моча, пот, амниотическая жидкость и т.д. С помощью данного метода можно определить в биологических жидкостях активность ферментов или содержание некоторых продуктов метаболизма.

Практически во всех случаях биохимическая диагностика включает 2 уровня: первичный и уточняющий. Целью первичного уровня диагностики является исключение здоровых индивидов из дальнейшего обследования, для этого используют 2 вида программ диагностики: массовые и селективные. Массовые просеивающие программы применяют для диагностики у новорожденных таких заболеваний как фенилкетонурия, врожденный гипотериоз, муковисцедоз, галактоземия. Например, для диагностики фенилкетонурии кровь новорожденных берут на 3-5 день после рождения. Капли крови помещают на хроматографическую или фильтровальную бумагу и пересылают в лабораторию для определения фенилаланина.

Для определения врожденного гипотереоза в крови ребенка на 3 день жизни определяют уровень тироксина. Просеивающая программа массовой диагностики наследственных болезней применяются не только среди новорожденных. Они могут быть организованны для выявления тех болезней которые распространены в каких либо группах населения. Например с США организована просеивающая биохимическая программа по выявлению гетерозиготнвх носителей идиотии Тей-Сакса (она чаще встречается среди евреев-ашкенази). На Кипре и в Италии организовано биохимическое исследование гетерозиготных несителей талассемии.

Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни.

В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии или тест с динитрофенилгидрозином для выявления кетокислот в моче) или более точные методы. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот и мукополисахаридов. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.

На сегодняшний день в нашей стране внедрена программа обязательного селективного скрининга на определение наследственных болезней обмена веществ, с проведением 14ти тестов анализов мочи и крови: на белок, кетокислоты, цистин и т.д. На втором этапе, применяя методы тонкослойной хроматографии мочи и крови, можно выявить более 140 наследственных болезней обмена веществ, такие как болезни углеводного обмена, лизосомальные болезни накопления, болезни обмена металлов, аминоацидопатии и т.д.

Широкое применение нашел биохимический метод в пренатальной диагностике врожденных пороков развития. Биохимические методы включают определение уровня альфа- фетопротеина, хорионического ганадотропина в сыворотке крови беременной. Эти методы являются просеивающими для выявления врожденных пороков развития. Например, при дефектах невральной трубки повышается уровень альфа-фетопротеина.

Цитогенетический метод.

Цитогенетический метод, основанный на изучении количества и структуры хромосом в норме и при патологии.

Основными показаниями для цитогенетического исследования являются:

1) пренатальная диагностика пола плода в семьях, отягощенных заболеваниями, сцепленными с Х-хромосомой;

2) недифференцированная олигофрения (слабоумие);

3) привычные выкидыши и мертворождения;

4) множественные врожденные пороки развития у ребенка;

5) бесплодие у мужчин;

6) нарушение менструального цикла (первичная аменорея);

7) пренатальная диагностика при возрасте матери старше 35 лет.

Этот метод стал широко применяться в медицинской практике с 1956 года, когда Тио и Леван определили, что у человека 46 хромосом. Первая классификация хромосом человека, предложенная в Денвере заложила основу для последующих номенклатур хромосом.

Наиболее современной считается Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека сокращенно ISCN, принятая в Вашингтоне в 1995 году.

Согласно последней номенклатуре в хромосоме длинное плечо обозначают q, а короткое p. В каждом районе хромосомы полосы и сегменты пронумерованы последовательно от центромеры к теломере. Использование метода дифференциального окрашивания хромосом позволяет выделять индивидуальный рисунок каждой хромосомы вследствие того, что в хромосоме участки эу- и гетерохроматина по-разному окрашиваются красителями.

Объектами для цитогенетического исследования служат метафазные хромосомы, которые можно изучать с помощью прямых и непрямых методов.

Прямые – это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования, их используют для изучения клеток костного мозга и клеток опухолей. Непрямые методы – это методы получения препаратов хромосом из культивированных в искусственных питательных средах, например, при культивировании лимфоцитов периферической крови человека.

С помощью непрямых методов возможно проводить: кариотипирование – определение количества и качества хромосом; генетический пол организма; диагностику геномных мутаций и хромосомных аберраций. Например, синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме), синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме), синдром «кошачьего крика» (делеция 5-й хромосомы), синдром Вольфа-Хиршхорна (частичная моносомия 4-й хромосомы).

Для изучения половых хромосом, в частности Y-хромосомы, используют специальную окраску акрихиниприт (флюоресцирующая) и исследование проводят в ультрафиолетовом свете. Y-хроматин – это сильно светящаяся точка, обнаруживается в ядрах клеток мужского организма, и число Y-телец соответствует числу Y-хромосом в кариотипе. Окончательный диагноз хромосомной болезни выставляется только после исследования кариотипа.

Чтобы быстро определить изменения числа половых хромосом применяют экспресс-метод определения полового хроматина. Половой хроматин или тельце Барра представляет собой одну из двух X-хромосом, причем в инактивированном виде. Оно выявляется в виде сгустка треугольной или овальной формы около внутренней мембраны ядерной оболочки. В норме половой хроматин обнаруживается только у женщин. При увеличении числа Х-хромосом увеличивается и количество телец Барра. При уменьшении числа Х-хромосом (синдром Шерешевского-Тернера, кариотип 45 ХО) тельце Барра отсутствует. В норме у мужчин половой хроматин не обнаруживается, его наличие может свидетельствовать о синдроме Клайнфельтера (кариотип 47 ХХY).

Цитогенетический метод применяют для пренатальной диагностики наследственных заболеваний. Для этого проводят амниоцентез, получают амниотическую жидкость с клетками кожи плода, затем клеточный материал исследуют для дородовой диагностики хромосомных аберраций и геномных мутаций, а также пола плода. Обнаружение изменение количества и структуры хромосом дает возможность своевременного прерывания беременности с целью предупреждения потомства с грубейшими аномалиями развития.