Миллон реакциясы

Жұмыстың мақсаты: Белок құрамындағы тирозин қалдығын анықтау.

Белок ерітіндісін Миллон реактивміен (HNO₂ қоспасы бар сынаптың (ΙΙ) азот қышқылындағы ерітіндісі) қосып қыздырғанда, алдымен қызғылт, біраз уақыттан кейін қызыл-қошқыл түске боялатын тұнба түзіледі:

сынаптың динитротирозинмен комплексті тұзы

қызыл-қошқыл түсті

Жұмыс істеу реті: Екі пробиркаалып біріншісіне 5 тамшы1%-тік жұмыртқа белогының ерітіндісін, екіншісіне 5 тамшы 1%-тік бидай белогының ерітіндісін құяды. Содан соң әрбір пробиркаға 2-3 тамшыдан Миллон ерітіндісін қосып қайнатады, 1-2 минуттан кейін ерітіндінің түсі қызғылт артынан қызыл-қошқыл түске ауысады. Пробиркалардағы ерітінділердің түстерін салыстыра отырып қорытынды жасаңыз.

7. Зертханалық жұмыс

Қарапайым белоктарды диализ әдісі арқылы бөлу.

Белоктрадың ерігіштігі еріткіш табиғатына, ортаның рН көрсеткішіне, ерітіндінің иондық күшіне және молекула құрылымына байланысты. Кейбір белоктар суда ериді, екінші біреулері тұздардың сұйық ертіндісінде, үшіншілері еріткіште ерімейді.

Белоктардың суда және су ерітінділерінде ерігіштігі олардың құрылымына, яғни амин қышқылдары қалдығындағы бүйірлік топтарға және олардың иондануына байланысты. Белоктардың тұзды ерітіндідегі ерігіштігі иондық күшке (μ әрпімен белгіленеді) тәуелді. Ондай күшті табу үшін әр ион концентрациясы қосындысының жартысын оның валенттілігі (яғни заряды) квадратына көбейтеді:

μ = ½ ∑ С∙ Z²;

мұндағы С - әр ионның концентрациясы;

Z – ионның электр заряды.

Бұл формуладан мынадай қорытынды шығаруға болады: иондық күш төмен болған кезде белоктың ерігіштігі артады. Ерітіндінің иондық күші артқан кезде белоктың ерігіштігі төмендейді де, белок ерітндінің түбіне шөгеді.Тұздың концентрациясы жоғары болған кезде белоктарды тұнбаға шөктіру осыған негізделген.

Белоктардың тұнбаға шөгуі су молекулаларына қатысты тұз бен белоктың өзара бәсекесіне байланысты. Бұл кезде тұз иондары судың көпшілік бөлігімен байланыса алады да, белокты ерітетін судан азғантай ғана қалады, сондықтан белоктың ерігіштігі төмендейді де, ол тұнба бөліп шөгеді.

Белоктың ерігіштігі ортаның рН шамасына байланысты. рН шамасы изоэлектрлік нүктеге жақындаған кезде белок молекулалары арасындағы бірін-бірі итеру күші азаяды, белок молекулалары бірігіп үлкейеді де, белок тұнбаға түседі.

Белоктар гидрофильді коллоидты ерітінділерге жатады және ерігіштігі бойынша төмендегідей бөлінеді:

1. Альбуминдер – суда еритін белоктар;

2. Глобулиндер – тұздың судағы ерітінділерінде ериді (10% NaCl). Бұл белоктар әсіресе бұршақ тұқымдастарында көп;

3. Проламиндер – 60-80%-дық этил спиртінде еритін белоктар. Белоктардың бұл түрі тек дәнді-дақылдардың тұқымында кездеседі;

4. Глютелиндер – сілті ерітінділерінде ериді.

Өсімдік материалдарынан белокты бөліп алу, оларды сәйкес еріткіштерде ерітуден басталады. Егер альбумин керек болса экстракцияны сумен жүргізеді. Соңынан белоктың судағы ерітіндісін тұзбен қанықтыру арқылы немесе органикалық еріткіштермен тұнбаға түсіреді.

Реактивтер: белоктың 5-10% NaCl-дағы ерітіндісі; 5% AgNO₃; 1% CuSO₄; 10% NaOH; 10% HNO₃; дистильденген су.

Құрал жабдықтар: целлофан қиығы, шыны стакан, шыны таяқша, резеңке сақина, пробиркалар.

Жұмыс №1

Альбуминді бөлу:

Жұмыс істеу реті: пробиркаға 1г бидай ұнын салып, оған 10 мл дистильденген су құйып араластырады. Пробирканы термостатқа немесе стакандағы жылы суға (30-35º С) 30 минутқа салып қояды. Алғашқы 20 минутқа дейін пробирканы ауық-ауық араластырып тұрады. 30 минуттан соң тұнбаның үстіндегі альбумині бар сұйықты сүзеді. Фильтраттың, яғни тұнбаның бар бөлігімен (1-2мл) биурет реакциясын жасап белокты анықтайды да, екінші бөлігіне NaCl-дың қаныққан ерітіндісінің теңдей мөлшерін құяды. Бұл кезде ерітінді лайланады, өйткені альбумин тұздардың қатысында ерігіштігін жоғалтады.

Жұмыс №2

Глобулинді бөлу:

Жұмыс істеу реті: пробиркаға 1г бұршақ ұнын салып, оған 10мл 10%-дық NaCl ерітіндісін қосып қыздырады. Қоспаны 30-35º С температурада 30 минут ұстайды. Содан соң сұйықты сүзіп оның бір бөлігімен биурет реакциясын жасап белокты анықтайды. Глобулиндер таза суда ерімейді, егер ерітіндіні тұздан ажыратсақ, глобулиндер тұнбаға түседі. Ол үшін диализ әдісін қолданады.

Диализ әдісі мембрананы пайдалануға негізделген, мембранадан төменгі молекулалы заттардың иондары мен молекулалары өтіп кетеді де, ірі коллоидты бөлшектер қалып қояды. Диализ әдісін жүргізетін аспапты диализатор деп атайды. Ең қарапайым диализатор ретінде целлофан қалталарды пайдаланады. Сүзілген белок ерітіндісі құйылған қалтаны резеңке сақиналармен шыны таяқшаларға іліп стакандағы дистильденген суға батырып қояды. Диализді бөлме температурасында 1 сағат бойы жүргізеді. Диализденетін ерітінді тұзсызданған сайын тұзда еритін белоктар тұнбаға түсе береді. Ал суда еритін белоктар – альбуминдер ерітіндісінде қалады. Диализ өткен соң қалтадан және стакандағы дистильденген судан проба алып, Cl^- ионына және белокқа сапалық реакция жасайды.

а) Cl^- ионының сапалық реакциясы: 2 пробирка алып, біреуіне 1-2мл белок ерітіндісін, ал екіншісіне 1-2мл стакандағы судан құяды. Екі прбиркаға да 2-3 тамшыдан 10%-дық HNO₃ және 5%-дық AgNO₃ қосады. Не байқалады? Неге?

б) Биурет реакциясымен белокты анықтау: Бір пробиркаға 1-2мл белок ерітіндісін, ал екінші пробиркаға стакандағы судан 1-2мл құяды. Пробиркалардың әрқайсысына 1-2мл 10%-дық NaOH және 5 тамшыдан 1% CuSO₄ қосады. Не байқалады? Неге?

Жұмыс №3

Проламинді бөлу:

Жұмыс істеу реті: пробиркаға 1г бидай ұнын салып, оған 10мл 70% (С₂Н₅ОН) этил спиртін құяды. Экстракцияны 30-35º С температурада ауық-ауық араластыра отырып, 30 минут жүргізеді; содан соң тұнбаның үстіндегі сұйықты сүзеді. Оның бір бөлігімен биурет реакциясын жасайды да, қалған бөлігін дистильденген сумен 2 есе сұйылтады. Бұл кезде спирттің концентрациясы күрт төмендейді де, спиртте еритін проламиндер ерігіштігін жоғалтады. Ерітінді лайланады.

15.3. Зертханалық жұмыстар

8. Зертханалық жұмыс

Ферменттердің спецификалық түрлері

Ферменттердің айырықша қасиеті – жоғарғы спецификалық түрі. Әр фермент бір-біріне құрылысы жағынан ұқсас субстратқа немесе топты субстратқа әсер етеді.

Спецификалық түрлері: абсолюттік, топтық, стереохимиялық. Әр ферменттің спецификалық түрлері әр түрлі жолмен анықталады.

Реактивтер: 2%-дық крахмал және сахароза қоспасы, амилаза және интерфаза ферменттері.

Жұмыс істеу реті: 4 пробирка алып, 1-ші және 2-ші пробиркаларға 2мл 2%-тік крахмал қоспасын, ал 3-ші және 4-ші пробиркаларға 2мл сахароза қоспасын құямыз. Содан соң 1-ші және 3-ші пробиркаларға 0,5мл амилаза ферментін, ал 2-ші және 4-ші пробиркаларға 0,5мл интерфаза ферментін қосамыз. Пробиркалардағы қоспаларды жақсылап араластырып, 40º С-тық су буында 15 минут ұстаймыз. Одан кейін пробирканы суытып, йодпен және Троммер реакциясын жүргіземіз. Троммер реакциясы үшін 1мл ерітінді алынады, ал қалған ерітінділерге 2-3 тамшы йод ерітіндісін қосады. Тәжірибе қорытындысын 1-ші кестеге жазамыз.