Метод фракционирования или дифференциального центрифугирования

Методы цит.исследования. Световой микроскоп-методы наблюд. Клетки

Методы цитологического исследования: 1) Непосредственное наблюдение живых клеток в организме или в свежевыделенной ткани.

2) Наблюдение клеток убитых с помощью фиксации, которая сохраняет морфологическую и химическую структуру.

После фиксации любой материал подвергают окрашиванию Красители – натуральные и синтетические. Натуральные: гематоксилин, кармин употребляют с окисями металлов, с которыми красители образуют комплексные соединения.

Синтетические – кислые и основные. Основные - соли красящих оснований, содержащие аминогруппы, мономитиламиногруппы, иминогруппы. Эти группы определяют щелочность красителей. Попадая внутрь клетки, эти группы образуют солевые связи с кислотами, находящимися в структуре клетки, что приводит к их окрашиванию. Кислотные группы клетки - базофильные.

Кислые красители – красящие кислоты или их соли (эозин, пикриновая кислота, азокармин и др.). Кислотные свойства придают нитрогруппы, гидроксильные, карбоксильные группы. Структурные компоненты – ацитофильные или оксифильные.Широкое распространение получило гистохимическое или цитохимическое окрашивание, которое подразделяется на прямое или косвенное. К прямым методам относят приемы, специфичные для вещества, которые хотят определить. Выявление ДНК – с реактивом Шиффа. Чтобы обнаружить активность фермента, используют непрямой гистохимический способ или метод ферментативного переваривания. Для этой цели клетки помещают в среду, содержащую субстрат для данной ферментативной реакции и реагенты, связывающие специфически с конечными продуктами реакций. Краситель Азу связывает и окрашивает цитоплазму, ядро и ядрышко. Предварительная обработка клетки ферментом РНК-азой приводит к тому, что цитоплазма и ядрышко будет окрашиваться слабо, а ядро не изменит в своей окраске. Если же клетку предварительно обработать ДНК-азой, то почти полностью исчезнет окрашивание структур ядра.

На современном этапе особое значение имеют точные способы выявления структур – иммунохимические методы. Это реакции с использованием флуоресцентных антител. Для этого на белок, который хотят определить, получают специфическую сыворотку. В сыворотке содержатся антитела, их соединения с красителями называют флюараконы. Затем, меченый белок вводят в клетку.

Таким образом был открыт цитоскелет.

Сначала получают чистые клетки, разрушая ткань в гомогенизаторах. Полученную суспензию (гомогенат) подвергают высокоскоростному центрифугированию. Крупные компоненты (ядра или неразрушенные мембранные структуры) оседают при низких скоростях 1-3 тыс. При более высоких скоростях (15-30 тыс.) оседают более мелкие частицы (макросомы). Более 50 тыс. – микросомы. 15-20% от общей массы. Имеют сложный химический состав. ЭПР, вакуоли. 150 тыс. – в осадок выпадают рибосомы.С помощью раствора сахарозы получают более высокую степень разделения. Плотность раствора постепенно увеличивается сверху вниз. Гомогенат клеток наслаивают поверх сахарозы, затем центрифугируют и органоиды клетки распределяются в зависимости от своей молекулярной массы по высоте градиента, образуя отдельные полосы.