Определение ANA и ENA методом твердофазного ИФА

Тест-система для ИФА ANA (UBI MAGIWELL) - для скринингового анализа на антиядерные антитела обеспечивает полуколичественное определение широкого спектра антител к сорбированному в лунках комплексу различных клеточных ядерных антигенов: двухспиральной и одноцепочечной ДНК, гистонам, рибонуклеопротеинам (РНП), SS-A, SS-B, Sm и др.

Отличительной особенностью систем ИФА ENA- скрининг и ENA- профиль (CLARK LABORATORIES) является то, что на поверхности полистерольных лунок сорбированы предварительно высокоочищенные отдельные эксрагируемые ядерные антигены: SS-A, SS-B, Sm, Sm/РНП, Scl-70 и Jo-1. В скрининговом варианте - все 6 антигенов вместе, в профильном - каждый антиген в отдельной лунке. Таким образом, обычный алгоритм диагностики заключается в первичном анализе сыворотки на скрининговой системе и повторной постановке анализа положительных сывороток на тест-системе ENA - профиль для выявления антител к конкретным антигенам. В случае положительного теста на скрининговой ANA -системе и отрицательного результата в тест-системах ENA - необходимо тестирование сыворотки на тест-системах для изолированного определения антител к ДНК, гистонам и другим антигенам, отсутствующим в системах ENA.

 В случае установленного диагноза и выявленным ранее аутоантителам - для мониторинга эффективности терапии используются тест -системы для количественного определения титра антител к отдельным антигенам.

В качестве альтернативы плашечным тест- системам можно использовать пробирочные ИФА тесты фирм "ROCHE" и "Sanofi".

Положительные результаты серологического тестирования на ANA и ENA могут наблюдаться у 1 - 5 % здоровых лиц, особенно в пожилом возрасте. Определенные лекарства, например такие, как р-аминосалициловая кислота, фенитион, изониазид, гидразин, прокаинамид и некоторые другие могут индуцировать образование антиядерных антител.

 

7. АУТОАНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ СИСТЕМНЫХ ВАСКУЛИТОВ

Системные васкулиты – группа заболеваний, которые характеризуются хроническим воспалением и деструкцией стенок кровеносных сосудов. Этиологические факторы выполняющие тригерную роль включают: инфекционные агенты, медикаментозные препараты, опухолевую прогрессию, циркуляцию патологических белков и ЦИКов, аутоантитела. Вместе с тем, около половины всех случаев системных васкулитов не имеют явной этиологической обусловленности и расцениваются как «идиопатические». Важно помнить, что некоторые васкулиты со сходными клиническими проявлениями могут иметь существенно различный прогноз и требовать различных терапевтических подходов.

До сих пор, окончательно не отработаны классификационные схемы данной группы заболеваний. Последние классификации базируются на калибре преимущественно поражаемых сосудов и преобладающему в очаге деструкции типу клеточных элементов: нейтрофилов, моноцитов или лимфоцитов. Правда, это скорее отражает стадию процесса, нежели доминирующий патогенетический процесс. 

Появление возможности определения аутоантител к нейтрофильным цитоплазматическим антигенам (ANCA) значительно улучшило диагностику этих заболеваний. Существуют два подкласса аутоантител к нейтрофилам человека: c-ANCA (цитоплазматические ANCA) и p-ANCA (перинуклеарные ANCA). Наиболее значимыми являются антитела к ферментам первичных гранул нейтрофилов: протеиназе-3 (PR3) и миелопероксидазе (МРО), соответственно. Определение спектра ANCA (PR3, MPO) позволяет проводить дифференциальную диагностику грануломатоза Вегенера и микроскопического полиартериита. Использование ANCA как показателя активности васкулита имеет определенные преимущества перед такими классическими показателями как СОЭ и СРБ, более адекватно отражая степень активности и эффективность проводимой терапии и независимо от присоединения инфекционных осложнений.

 Таблица 8. Диагностическая значимость выявления различных противонейтрофильных (ANCA) –антител

Вид антител	Заболевание
Анти-МРО ANCA	Васкулиты, микроскопический полиангиит, с.Черджа-Стросса, РА, СКВ
Анти-PR3 ANCA	Грануломатоз Вегенера
Анти-BPI ANCA	Хронические инфекционные болезни, болезнь Крона, язвенный колит
Анти-эластаза ANCA	Эмфизема, РА, воспалительные ревматические болезни
Анти-катепсин G ANCA	воспалительные ревматические болезни, СКВ, синдром Шегрена, синдром Фелти
Анти- лизоцим ANCA	Ревматоидный васкулит, воспалительные процессы в ЖКТ, язвенный колит
Анти-лактоферин ANCA	РА, язвенный колит, первичный склерозирующий холангит

 

8. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА

Антитела к фосфолипидам представляют собой гетерогенную группу аутоантител против отрицательно заряженных фосфолипидов. Они обнаруживается, в первую очередь, в тесте, определяющем антитела против кардиолипина (АСА-тест), дают ложноположительные реакции в биологических тестах на сифилис и в антикоагулянтном тесте на волчанку. Все эти три теста обнаруживают схожие, но необязательно идентичные антитела. Таким образом, для того, чтобы идентифицировать антитела к фосфолипидам, иногда приходятся использовать все перечисленные тесты.

Из различных существующих методов анализа для определения антител к фосфолипидам наиболее чувствительным   является    твердофазный иммуноферментный метод определения антител к кардиолипину. Присутствие этих антител у пациентов помогает выявлять больных с риском венозного и/или артериального тромбоза, часто сопровождающегося тромбоцитопенией.

Термин антифосфолипидный синдром был предложен для обозначения группы заболеваний, сопровождающихся повышенным количеством аутоантител к фосфолипидам и подразделяется на первичный (не связанный с определенной аутоиммунной патологией) и вторичный, асоциированный с СКВ или другими аутоимунными болезнями.

 Антифосфолипидный синдром наиболее часто проявляется у пациентов с системной красной волчанкой или у больных волчанко-подобными заболеваниями, где критерии системной красной волчанки не выполняются. Высокие уровни антител к кардиолипину наблюдаются при тромбозах, при потере плода, при тромбоцитопении и некоторых других заболеваниях. Низкие уровни антител к кардиолипиду были найдены при различных клинических нарушениях, не относящихся к антифосфолипидному синдрому. Поэтому низкие уровни этих антител имеют ограниченное диагностическое значение.

Антифосфолипидный синдром связан более четко с антителами к кардиолипину классов IgG и IgA, чем с антителами класса IgM. Однако, при лечении наибольшим образом изменяется уровень lgM-антител. Низкие уровни антител класса IgM можно наблюдать и при других аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидные артриты, первичный синдром Шенгрена, системная волчанка, вызванная применением лекарств, болезнь Лайма и сифилис.

 

Тест-система ImmuLisa™ ACA-Screen EUSA является удобным инструментом для предварительного выявления тех пациентов, в крови которых содержатся АСА. Последующий анализ позитивных сывороток с помощью наборов ImmuUsa™ ACA-IgG, ImmuUsa™ ACA-lgA, ImmuUsa™ ACA'IgM позволяет определить индивидуальные изотипы этих аутоантител.

 

Таблица 9. Синдромы, связанные с АСА

Синдром	% встречаемости
Периодический тромбоз вен	28-71
Частые выкидыши	28- 64
Поперечный миелит	50
Гемолитическая анемия	38
Тромбоцитопения	27-33
Окклюзии артерий	25 -31
Livedo Riticularis (мраморная кожа)	25
Легочная гипертензия	20 - 40
СКВ	33-57

 

Как показали проведенные исследования у пациентов с антифосфолипидным синдромом огромное значение имеет наличие антител не только к кардиолипину (АСА), но и к фосфатидилсерину, последние могут обнаруживаться как совместно с АСА, так и отдельно.

 При СКВ АСА достаточно хорошо связываются и с фосфатидилсерином, в то время как некоторых инфекционных заболеваниях, АСА высокоспецифичны к кардиолипину. В связи с этим, определение отдельно антител к фосфатидилсерину является важным диагностическим критерием вторичного антифосфолипидного синдрома.

Показания для исследования на антифосфолипидный синдром:

- тромбозы и васкулиты при аутоиммунных заболеваниях (оценка тяжести состояния, прогноз и мониторинг терапии)

- частое прерывание беременности или внутриматочная гибель плода (возможность результативной профилактики в течение новой беременности)

- неясные неврологические проявления (хорея, мигрень, эпилепсия могут быть вызваны микротромбозами)

- рецидивирующая тромбоцитопения неясного генеза (уточнение диагноза)

- мраморная кожа

9. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЭНДОКРИНОПАТИЙ

Некоторые эндокринные заболевания сопровождаются появлением аутоантител, которые, в ряде случаев играют существенную роль в их патогенезе. К числу таких заболеваний относятся: инсулин- зависимый диабет 1 типа, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, узелковый тиреоидит, синдром "кандидоза- эндокринопатии" и тд.

Определение антител к b- клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы.

 Известно, что ключевым моментом  в развитии инсулинзависимого сахарного диабета 1 типа является феномен превращения b- клеток из "своего" в "не свое" и активацией их аутоиммунного поражения. При медленном течении болезни самым ранним признаком патологии служит появление антител к b- клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы и, конкретно, к мембраносвязанной декарбоксилазе глутаминовой кислоты в период, когда уровень сахара в крови еще не превышает нормы, а толерантность к глюкозе остается нормальной. Поскольку первые клинические проявления диабета проявляются при поражении более 90% всех инсулин -синтезирующих клеток, антитела могут появляться за много лет (до 8 лет) до клинической манифестации болезни. Вместе с тем, присутствие антител к b- клеткам коррелирует с их остаточным количеством и по мере гибели оставшихся b- клеток снижается стимул к аутоиммунному ответу титр аутоантител может существенно снижаться вплоть до неопределяемых значений. Как правило, при обследовании лиц, страдающих диабетом 1 типа антитела к островковым клеткам выявляются в 50 - 80 % случаев. Частота встречаемости этих аутоатител у родственников (1-ой степени) диабетиков достигает 2 - 5 %. Известно, что ежегодно у 11% этой группы людей возникают симптомы диабета.

 Определение антител к b- клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы проводится как методом непрямой иммунофлуоресценции, так и методом твердофазного ИФА. В первом случае в качестве субстрата используются срезы поджелудочной железы обезьян, во втором- в лунках планшета сорбируются очищенные антигены островковых клеток. Гемолиз, липемия и микробная контаминация препятствуют проведению анализа. Сыворотки, содержащие большую концентрацию ANA затрудняют определение, особенно при проведении РНИФ.