Определение количества белка в моче по реакции с сульфосалициловой кислотой

Принцип метода. Концентрация белка в моче пропорциональна помутнению, появляющемуся при его коагуляции сульфосалициловой кислотой.

Реактивы: 1) 3% раствор сульфосалициловой кислоты (C₇H₅O₆S); 2) 0,9% раствор NaCl; 3) 1% стандартный раствор альбумина: 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9% раствора NaCl в колбе емкостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же растворителем. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5% раствора азида натрия (NaN₃). При хранении в холодильнике реактив стабилен в течение 2 месяцев.

Ход определения. В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, добавляют 3,75 мл 3% раствора сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин пробу фотометрируют на ФЭКе при длине волны 590–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете с длиной оптического пути 5 нм. Контролем служит проба, в которой к 1,25 мл мочи добавлено 3,75 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочному графику, для построения которого готовят разведения стандартного раствора альбумина (см. таблицу: Приготовление разведений для построения калибровочного графика).

Приготовление разведений для построения калибровочного графика

Из каждого полученного разведенного раствора берут по 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

Примечание. Прямолинейная зависимость величины экстинкции и концентрации белка сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях белка пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

При наличии в моче веществ, содержащих йод, могут быть получены ложноположительные результаты. Поэтому тест нельзя использовать у больных, принимающих препараты йода или прошедших исследование с применением йодсодержащих рентгено-контрастных соединений. Ложноположительные реакции при проведении исследования могут быть вызваны приемом сульфаниламидных лекарственных средств, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод

Принцип метода. Пептидные связи белка с солями меди в щелочной среде образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

Реактивы. 1) 10% раствор ТХУ; 2) 20% раствор сульфата меди (CuSO₄ × 5Н₂O); 3) 3% раствор NaOH.

Ход определения. К 5 мл мочи прибавляют 3 мл 10% раствора ТХУ, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, а осадок растворяют в 1 мл 3% раствора NaOH и добавляют 0,25 мл 20% раствора CuSO₄, смесь перемешивают и центрифугируют. Центрифугат фотометрируют при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочному графику, который строят так же, как описано в предыдущем методе. На оси абсцисс откладывают оптическую плотность в единицах экстинкции, а на оси ординат — концентрацию белка в г/л. При анализе суточной мочи рассчитывают потерю белка за сутки.

Определение белка с использованием индикатора пирогаллолового красного

Принцип метода основан на фотометрическом измерении оптической плотности раствора окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии молекул белка с молекулами комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия (Pyrogallol Red-Molybdate complex) в кислой среде. Интенсивность окраски раствора пропорциональна содержанию белка в исследуемом материале. Наличие детергентов в реактиве обеспечивает равнозначное определение белков разной природы и строения.

Реактивы. 1) 1,5 ммоль/л раствор пирогаллолового красного (ПГК): 60 мг ПГК растворяют в 100 мл метанола. Хранят при температуре 0–5 °С; 2) 50 ммоль/л сукцинатный буферный раствор pH 2,5: 5,9 г янтарной кислоты (НООС–СН₂–СН₂–СООН); 0,14 г оксалата натрия (Na₂C₂O₄) и 0,5 г натрия бензоата (C₆H₅COONa) растворяют в 900 мл дистиллированной воды; 3) 10 ммоль/ л раствор кристаллогидрата молибдата натрия (Na₂MoO₄ × 2H₂O): 240 мг молибдата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды; 4) Рабочий реактив: к 900 мл сукцинатного буферного раствора добавляют 40 мл раствора ПГК и 4 мл раствора молибдата натрия. pH раствора устанавливают 2,5 с помощью 0,1 моль/л раствора соляной кислоты (НСl) и доводят его объем до 1 л. Реактив в таком виде готов к использованию и стабилен при хранении в защищенном от света месте и температуре 2–25 °С в течение 6 мес; 5) 0,5 г/л стандартный раствор альбумина.

Ход определения. В первую пробирку вносят 0,05 мл исследуемой мочи, во вторую пробирку — 0,05 мл стандартного раствора альбумина и в третью пробирку (контрольная проба) — 0,05 мл дистиллированной воды, затем в эти пробирки добавляют по 3 мл рабочего реактива. Содержимое пробирок перемешивают и через 10 минут фотометрируют пробу и стандарт против контрольной пробы при длине волны 596 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Расчет концентрации белка в исследуемой пробе мочи осуществляют по формуле:

С = 0,5 × А_пр / А_ст,

где С — концентрация белка в исследуемой пробе мочи, г/л; А_пр и А_ст— экстинкция исследуемой пробы мочи и стандартного раствора альбумина, г/л; 0,5 — концентрация стандартного раствора альбумина, г/л.

Примечания:

• окраска раствора (цветного комплекса) стабильна в течение одного часа;
• прямо пропорциональная зависимость между концентрацией белка в исследуемой пробе и поглощением раствора зависит от типа фотометра;
• при содержании белка в моче выше 3 г/л пробу разводят изотоническим раствором натрия хлорида (9 г/л) и повторяют определение. Степень разведения учитывают при определении концентрации белка.

Приложение 3