Методы определения белка

Цель работы: изучить методы исследования белка.

Определение массовой доли белков методом

формольного титрования

Аппаратура, реактивы и материалы. Пипетки простые вместимостью 20 и 50см³ и градуированные вместимостью 1 и 5см³; стаканы химические вместимостью 150-200 см³, бюретка вместимостью 25см³ с ценой деления 0,1см³, снабжённая трубкой с натронной известью для защиты раствора гидроксида натрия от углекислого газа, и бюретка вместимостью 50см³ с ценой деления 0,1см³; резиновая груша; гидроксид натрия, ч.д.а. или х.ч. 0,1н и 40 %-ный растворы; раствор гидроксида натрия готовят на дистиллированной воде, свободной от диоксида углерода; спирт этиловый ректификованный или спирт синтетический; фенолфталеин (2 %-ный спиртовой раствор); формалин технический; 2,5 %-ный водный раствор сульфата кобальта ч. или ч.д.а., сульфит натрия ч.д.а. или ч.; 1 н раствор серной кислоты; вода дистиллированная, свободная от диоксида углерода.

Для определения содержания формальдегида в техническом формалине готовят раствор сульфита натрия: 126 г сульфита натрия кристаллического (Na₂SO₃ x 7H₂O) или 63г безводного сульфита натрия (Na₂SO₃) растворяют в мерной колбе вместимостью 500см³ и объём доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор сульфита натрия в количестве 50см³ нейтрализуют 1н. раствором серной кислоты в присутствии фенолфталеина до слабо-розовой окраски и добавляют точно 3см³ испытуемого формалина. Образовавшийся в результате реакции гидроксид натрия титруют 1 н. раствором серной кислоты до слабо-розовой окраски.

Количество 1 н. раствора серной кислоты (в см³), израсходованной на титрование образовавшегося гидроксида натрия, показывает количество формальдегида, содержащегося в 100см³ формалина (г/100см³). Для определения количества белка допускается применять формалин с содержанием формальдегида не менее 36г на 100см³. При наличии мути или осадка раствор формалина перед употреблением фильтруют.

Формалин перед употреблением нейтрализуют: к 50см³ формалина добавляют 3-4 капли 2 %-ного раствора фенолфталеина и затем по каплям приливают сначала 40 5-ный, а затем в конце 0,1 н раствор гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания.

Формалин, оставшийся на следующий день, в случае необходимости дополнительно нейтрализуют 0,1н. раствором гидроксида натрия. Нейтрализация формалина, в котором образовался осадок, производится после фильтрования.

Для приготовления эталона окраски в химический стакан вместимостью 150-200см³ отмеривают пипеткой 20мл молока и добавляют 0,5мл 2,5 %-ного раствора сульфата кобальта. Эталон пригоден для работы в течении одной смены. Для лучшего сохранения к эталону можно добавить одну каплю формалина. Во избежание отстоя сливок эталон рекомендуется перемешивать.

Таблица 4.6 - Определение содержания белков в молоке при титровании проб в присутствии формалина

Количество 0,1н. раствора NaOH, см3	Массовая доля белков в молоке, %	Количество 0,1н. раствора NaOH, см3	Массовая доля белков в молоке, %
2,45 2,5 2,55 2,6 2,65 2,7 2,75 2,8 2,85 2,9 2,95 3,05 3,1 3,15 3,2 3,25	2,35 2,4 2,44 2,49 2,54 2,59 2,64 2,69 2,73 2,78 2,83 2,88 2,93 2,98 3,03 3,07 3,12	3,3 3,35 3,4 3,45 3,5 3,55 3,6 3,65 3,7 3,75 3,8 3,85 3,9 3,95 4,05 4,1	3,16 3,21 3,25 3.31 3,35 3,4 3.45 3,5 3,55 3,6 3,65 3,69 3,74 3,79 3,84 3,89 3,94

Ход работы

В химический стакан вместимостью 150-200 см³ отмеривают с помощью пипетки 20 см³ молока и добавляют 0,25 см³ 2 %-ного раствора гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания, соответствующего окраски этанола. Затем в стакан вносят 4 см³ нейтрализованного 36-40 %-ного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин вторично титруют до появления слабо-розового окрашивания.

Если испытания проводят при искусственном освещении, то для точного определения момента появления окраски используют белый экран, для чего лист чертёжной бумаги размером 40 х 40 см сгибают пополам.

Массовая доля (в %) общего количества белков в молоке равна количеству 0,1н. раствора гидроксида натрия, затраченного на нейтрализацию в присутствии формалина, умноженному на 0,959. Массовую долю общего белка в молоке можно определить также по таблице.

Колориметрический метод определения белка (по Лоури)

Аппаратура, реактивы и материалы: 1) 2 %-й раствор Na₂СО₃ в 0,1н NaОН; 2) раствор 0,5 % CuSO₄ х 5Н₂О в 1 %-м растворе двухзамещённого виннокислого натрия или калия; 3) опытный раствор: готовят смешивая 1-й и 2-й растворы (50: 1 по объёму); реактив годен в течении дня; 4) реактив Фолина.

Приготовление реактива Фолина. Для стандартного раствора 100г вольфрамата натрия (Na₂WO₄ x 2H₂O) и 25г молибдата натрия Na₂МоО₄ х 2H₂O растворяют в 700см³ воды. К смеси добавляют 50см³ 85 %-го раствора фосфорной и 100см³ соляной кислот (р = 1,19). Затем кипятят (не слишком сильно) 10 ч с обратным холодильником в вытяжном шкафу. После этого в колбу добавляют 150г сернокислого лития, 50 см³ воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят в течении 15 мин в вытяжном шкафу для удаления избытка брома, после охлаждения доводят водой до 1дм³. Затем фильтруют и хранят в тёмной склянке с притёртой пробкой. Раствор должен быть ярко-жёлтого цвета. Обычно перед употреблением реактив Фолина разбавляют в 2 раза. Раствор можно хранить длительное время.

Ход работы

К 0,4см³ раствора белка добавляют 2см³ опытного раствора. Смесь перемешивают и через 10мин приливают к ней 0,2см³ рабочего раствора Фолина. Интенсивность окраски определяют на ФЭК-56М с красным светофильтром (или на спектрофотометре при 750 нм) через 30мин. Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой 100 мг чистого белка (сывороточного γ – глобулина, кристаллического альбумина и др.) растворяют в 100см³ 0,1н NaОН (1см³ содержит 1мг белка). В 9 мерных колб на 10см³ приливают раствор белка в возрастающих количествах: 0,5см³, а затем от 1 до 8см³. Раствор в колбах доводят водой до метки, перемешивают и из каждой колбы берут по 0,4см³ для определения белка по указанной прописи. По полученным данным вычерчивают калибровочную кривую.

Примечание. Определение белка данным методом в растительных объектах, содержащих фенолы, приводит к завышению результатов, так как они образуют аналогичную окраску с реактивами. Перед определением белка для удаления фенольных соединений необходима обработка ацетоном, охлаждённым до –10^оС.

Определение белка колориметрическим методом

Аппаратура, реактивы и материалы.

В стеклянную пробирку помещают пипеткой 1см³ раствора молока, приливают 20см³ раствора красителя и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают её содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз.

Следует избегать встряхивания, так как при этом образуется трудноразрушимая пена.

Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при частоте вращения 1000 об/мин в течении 20 мин.

Отбирают пипеткой 1см³ надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50см³, доливают колбу до метки водой и содержимое перемешивают. Аналогичным способом разбавляют раствор красителя в 50 раз.

Измеряют на фотоколориметре оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленному содержимому мерной колбы.

Массовую долю белка (Б), %, вычисляют по формуле:

Б=7,78Д-1,34, (4.6)

где Д – измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотно-

сти;

7,78 – эмпирический коэффициент, % / ед. оптической плотно-

сти;

1,34 – эмпирический коэффициент, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений составляет + 0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,80 и расхождении между двумя параллельными измерениями не более 0,013 единиц оптической плотности или не более 0,1 % массовой доли белка.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов вычислений двух параллельных наблюдений, округляя результаты до второго десятичного знака.

Лабораторная работа № 6