Способы определения общего белка в сыворотке (плазме) крови и других биологических жидкостях

Известные способы определения концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови можно разделить на:

- азотометрические: классический метод Кьельдаля (1883) и его модификации;

- основанные на определении плотности сыворотки (плазмы);

- гравиметрические (весовые);

- нефелометрические;

- спектрофотометрические, заключающиеся в измерении степени светопоглощения в ультрафиолетовой области (200-220 или 280 нм);

- колориметрические, основывающиеся на цветных реакциях белков с оп­ределенными реактивами либо на неспецифическом связывании краси­теля;

- флюориметрические;

- поляриметрические;

- другие, к которым относят аминокислотный анализ, метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии и др.

Азотометрические методы. Определение белкового азота требует использования большого количества исходного биологического материала, значительных затрат времени для выполнения исследования и представляет собой достаточно сложную в техническом отношении процедуру. Способ, предложенный Кьельдалем, основан на полном разрушении белка под действием серной кислоты в присутствии катализатора. Высвобождаемый аммиак переходит в форму сульфата аммония, а затем, после подщелачивания гидролизата добавлением к нему концентрированного раствора едкого натра, перегоняется с паром или иным способом. После поглощения аммиака в кислотных ловушках содержание его определяется либо методом обратного титрования внесенного в устройство раствора кислоты известной нормальности щелочью, либо колориметрически, либо с применением электродов, чувствительных к аммиаку. Обычно аммиак анализируется первым способом, хотя возможно использование и других названных методов. Разработана система, объединяющая, прибор для определения аммиака по Кьельдалю с программируемым устройством для тцтрования.

Методы, основанные на определении плотности сыворотки крови (способом падающей капли), неточны, так как плотность зависит от содержания не толь­ко белков, но и других веществ, находящихся в плазме.

Рефрактометрический способ измерения концентрации общего белка также несовершенен, поскольку на показатель преломления влияют небелковые компоненты сыворотки крови, например, минеральные вещества, пигменты, углеводы, липиды, фракции остаточного азота. При некоторых патологических состояниях их содержание увеличивается, что приводит к значительным ошибкам в определении. Это касается исследования желтушных и хилезных сывороток, а также сывороток больных сахарным диабетом и страдающих уремией.

Гравиметрические методы базируются на предварительном осаждении белков, их обезвоживании высушиванием и определением массы на весах для,очень точного взвешивания (аналитические и др.).

Колориметрические методы достаточно просты, почти все из них не могут быть применены к исследованию одного-единственного, конкретного белка, к тому же он может отличаться по своей природе от белка-стандарта (эталона).

Из колориметрических способов особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции, впервые описанной в 1914 г.

В основе. метода Лоури (1951) лежит реакция с реагентом Фолина-Чокал­теу, активным компонентом которого является комплекс «молибдат-вольф­рамат-фосфорная кислота». Возникающее в ходе ее окрашивание раствора обусловливается одновременным протеканием биуретовой реакции и процес­са восстановления реактива Фолина циклическими аминокислотами - тиро­зином, триптофаном и другими, входящими в состав белковых молекул.

В последнее время для количественного определения белка стали применять проционовые красители. Их молекулы состоят из активной части (дихлортиази­нового кольца, специфически реагирующего с аминогруппами белков) и хромо­фобной части, обусловливающей цвет красителя.

Нефелометрuческuе, полярuметрuческuе методы из-за недостаточно высо­кой специфичности, чувствительности и друтих причин не получили широкого распространения в клинико-лабораторной практике.

Спектрофотометрuческuе методы. В связи со все возрастающим интересом к установлению содержания молекул средней массы (среднемолекуляр­ных пептидов) в последние годы несравненно большее внимание стало уде­ляться определению общего белка в биологических жидкостях способом ультрафиолетовой фотометрии (с использованием спектрофотометра типа СФ-26 и др.). Свойство поглощать световой поток с длиной волны 280 им обусловлено присутствием в белках аминокислот тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина.

Очень перспективным представляется высокочувствительный флюорuмет­рuческuй метод аналuза, основанный на включении в структуру белка или полипептида флюорогенной (т.е. способной к флюоресценции) метки. Так, ис­пользование флюоресцамина открыло возможность определения белка мето­дом люминесцентного анализа, причем в очень низких концентрациях. Флю­оресцамин, реагируя с первичными аминогруппами белка, образует комплекс, способный к испусканию света флюоресценции (475 нм) при ее возбуждении

Предложен также полярографический микрометод определения белка, отличаю­щийся весьма высокой чувствительностью (до 0,2 мкг в пробе) и простотой (прак­тически не требует проведения дополнительных процедур).

В качестве калибратора (стандарта) может быть использован бычий сыво­роточный альбумин, высушенный при 60·С в условиях вакуума (в эксикаторе) фосфорным ангидридом (P₂0_s) до постоянной массы.

Весьма чувствительный метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии позволяет определять белок в окрашенных или опалесцирующих растворах.

Из приведенного обзора методов определения общего белка следует, что в каждом конкретном случае в зависимости от цели исследования и с учетом ожидаемого содержания белка в анализируемой жидкости может быть выбран тот или иной метод анализа.

В качестве основного для использования в клинической лабораторной ди­агностике выбран колориметрический биуретовый метод определения общего белка в сыворотке (плазме) крови, что заставляет уделить особое внимание по­ложенной в его основу методологии.