Билет №19 метод флюоресцирующих антител

1. Иммунологические методы (ИМ) используются для выявления титра антител в сы­воротке крови(серодиагностика), обнаружения антигенов в биологических жидкостях.закономерности (ИМ): исследование проводится in vitro; проявляются при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела;протекают в 2 фазы(невидимая и видимая). Для количественной характеристики ИМ исследования используют понятия:чувствительность и специфичность. Чувствительность = Число положительных реакций у истинных больных/Число обследованных больных с подтвержденным диагнозом. Специфичность = Число отрицательных реакций в контрольной группе/Число обследованных в контрольной группех. Все ИМ делятся на 3 группы: ИМ, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феноменыагглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.); ИМ, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольнойаггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.); ИМ с использованием меченых антител или антигенов (флюоресцирующих антител, иммуноферментный, радиоиммунный анализы и другие методы).

Реакция агглютинации (РА) взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и дру­гих корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:специфическая фаза-связывание детерминантной группы (эпитопа) антигенас паратопом -активным центром иммуноглобулина(невидимая фаза); неспецифическая (видимая) фаза-образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. возможно лишь в электролитной среде,например в 0,85% растворе натрия хлорида. РА можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и,наоборот,при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифи­цировать выделенные микробы.. Реакция преципитации. участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами(преципитинами). Чаще всего эту реакцию применяют для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сы­воротке, содержащей антитела-преципитины. Это-качественный метод исследования.реакция Асколи-обнаружения антигена возбудителя сибирской язвы. стандартную иммунную сыво­ротку+ наслаивают жидкость, содержащую определяемый антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца (преципитина) свидетельствует «+». Средой для растворения-слой застывшего агара,в котором пробиваются лунки. В одну лунку помещают жидкость, содержащую исследуемый антиген,в другую -стандартную иммунную сыворотку.

Компоненты, входящие в состав антигена, диффундируют навстречу соответствующему антителу с различной скоростью. Комплекс антиген-антитело расположен в различных участках геля,где образуются линии пре­ципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген-антитело. Реакция иммуноэлектрофореза. сочетание электрофореза и реакции пре­ципитации. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток- происходит электрофорез белков,различные антигены перемещаются на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвиж­ности. После окончания электрофореза в канавку, расположенную по краю пластинки (параллельно направлению движения белков), вносят специфическую иммунную сыворотку. пластинку помещают во влажную камеру. В местах образования комплек­са антиген-антитело появляются дугообразные линии преципитации. Реакция связывания комплемента (РСК). РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней,риккетсиозов,вирусных инфекций. две фазы. Первая фаза-вза­имодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента,вторая выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело,то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител, комплементарных антигенуобразучощийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит, т.к.весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело,а эритроциты оста­лись неизменными. При отсутствии и в сыворотке антител, комплементарных антигену,специфический комплекс антиген-антитело не образуется,и комплемент остается несвязанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов-в пробирках обра­зуется так называемая «лаковая» кровь. все компоненты должны быть оттитрованы и взяты в реакцию в равных объемах.

Метод флюоресцирующих антител (МФА) реакция между антигеном и специфическим по отношению к нему антителом. Флюоресцирующие антитела-это иммунног-лобулины,выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами. Для этих целей используют изотиоцианат флюоресцеина (ФИТЦ). Меченный флюорохро-мом иммуноглобулин при нанесении на исследуемый мазок специфически адсорбирует­ся на поверхности антигена,прочно с ним связываясь.Если антиген не комплементарен антителу,то при промывании препарата такие антитела легко смываются.В России используют-прямой МФА.С целью уменьшения неспецифической флюоресценции исследуемых препаратов применяют контрастирование не­специфического свечения. Исследуемые препараты при этом окрашивают/смесью специфических флюоресцирующих антител, меченных ФИТЦ, обеспечивающим зеленое свечение, и альбумина нормальной сыворотки быка (БСА), меченного родамином, дающим красную люминесценцию фона. Результаты иммунофлюоресцентной микроскопии учитывают по интенсивности и специфической флюоресценции исследуемого объекта.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип ИФА аналогичен непрямому варианту МФА, но имеет ряд отличий:антитела или антигены фиксируются не на стеклах,а на внутренней поверхности полистироловых планшетов для иммунологических реакций;в качестве метки используется не флюорохром,а фермент(пероксидаза из корней хрена);Оценка реакции визуально,после добавления в лунку субстрата для данного фермента. Метод ИФА с использованием индикаторных полосок. Готовую полоску по­гружают в исследуемый образец.Антитела связывают молекулы антигена из об­разца.Затем индикаторную полоску переносят в раствор,содержащий конъюгат стандартного антигена с пероксидазой, субстрат для глюкозооксидазы (глюкозу) и хромоген (4-хлорнафол). Глюкозооксидаза катализирует превращение глюкозы в глюконовую кислоту с образованием перекиси водорода. Конъюгат связывается свободными антителами на полоске, и пероксидаза оказывается в непосредственной близости от области наи­большей концентрации перекиси водорода. Атомарный кислород, образующийся в результате ферментативного расщепления перекиси, окисляет хромоген. В результате образуется голубое нерастворимое соединение, которое проявляется на полоске. Интенсивность развивающейся окраски обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в образце. Регистрацию проводят визуально или с помощью фотометра, предназначенного для измерения отраженного света.

2. Натуральная оспа.

Вирус натуральной ос­пы — ДНК-содержащий, семейство Poxviridae, род Orthopoxvirus.

.Вирионы кирпичеобразную или овоидную форму. Вирус натуральной оспы — один из самых крупных вирусов, обнаружен в световом мик­роскопе. Вирионы видны при специальных методах окраски в виде так называемых элементарных телец Пашена (ок­раска серебрением по Морозову). Поверхность вириона состоит из нитевидных, овоидных эле­ментов. Оболочка и наружная мембрана вири­она заключают сердцевину (ДНК и белки) и мембрану сердцевины. Геном вириона — двунитевая линейная ДНК с ковалентно замкнутыми кон­цами. Вирусы имеют более 30 структурных белков. Антигены — нуклеопротеиновый, растворимые и гемагглютинин; имеются общие ан­тигены с вирусом вакцины.

размножается: в куриных эмбрионах с образованием белых бляшек на хорион-аллантоисной оболочке; в культуре клеток, в цитоплазме которых формируются ха­рактерные околоядерные включения.

Особо опасная конвенционная (ка­рантинная) инфекция. Источником инфек­ции является больной человек, который заразен с последних дней инкубационного периода и до отпадения корок высыпаний. Инфицирование происходит воздушно-капель­ным, воздушно-пылевым, а также контактно-бытовым путями при соприкосновении с ве­щами больного, загрязненными слизью, гноем, калом и мочой, содержащими вирус.

Вирус прони­кает через слизистые оболочки верхних ды­хательных путей, реже — через кожу и после размножения в регионарных лимфатических узлах попадает в кровь. Из крови возбудитель заносится в кожу и лимфоидные ткани, в которых происходит размноже­ние вирусов, формируются очаги поражения в коже, слизис­тых оболочках и паренхиматозных органах. Характерно образование папулезных высыпаний.

Инкубационный период 7—17 дней. Заболевание проявляется высокой температурой тела, рвотой, головной и поясничной болями, появлением сыпи. Первоначально сыпь имеет вид розовых пятен, которые затем переходят сначала в узелки — папулы, а затем — в пузырьки (везикулы) и пустулы, подсыхающие и превращающиеся в корки.

Различают несколько форм оспы: тяжелую (пустулезно-геморрагическая); среднетяжелую; легкую (оспа без сыпи, оспа без повыше­ния температуры тела).

Микробиологическая диагностика. Исследуют содержимое элементов сыпи, отделяемое носоглотки, кровь, пора­женные органы и ткани. Вирус выявляют при электронной микроскопии, в РИФ, РП, по образованию телец Гварниери. Выделяют вирус путем заражения куриных эмбрионов и культур клеток с последующей идентифика­цией в реакции нейтрализации (на куриных эмбрионах), РСК, РТГА. Серологическую диагностику проводят в РТГА, РСК, РИГА, реакции нейтрализации.

3. Бешенство

Таксономия: РНК-содержащий вирус, семейство Rhabdoviride, род Lyssavirus.

Морфология и антигенные свойства. Вирион имеет форму пули, состоит из сердцевины (РНП (рибонуклеопротеин) спи­рального типа и матриксного белка), окру­женной липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и внедрение вируса в клетку, обладает антигенными (типоспецифический антиген) и иммуногенными свойс­твами. Антитела к нему нейтрализуют вирус и выявляются в РН(рекция нейтрализации). РНП состоит из геномной однонитевой линейной минус-РНК и бел­ков: N-белка, L-белка и NS-белка. РНП является группоспецифическим антигеном; выявляется в РСК, РИФ, РП.

Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – не патогенный для человека.

Культивирование. Вирус культивируют путем внутримозгового заражения лабораторных животных (мышей, крыс) и в культуре клеток: фибробластов человека, кури­ного эмбриона. В нейронах головного мозга заражен­ных животных образуются цитоплазматические включения, содержащие антигены виру­са (тела Бабеша-Негри – эозинофильные включения).

Резистентность: Вирус бешенства неустой­чив: быстро погибает под действием солнеч­ных и УФ-лучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам.

Эпидемиология. Источниками инфекции в природных очагах являются волки, грызуны. Вирус бешенства накапливается в слюнных железах больного животного и выделяется со слюной. Животное заразно в последние дни инкубационного периода (за 2—10 дней до клинических проявлений болезни). Механизм передачи возбудителя — контактный при уку­сах. Иногда заболевание развивается при употреблении мяса больных животных или при трансплантации инфици­рованных тканей (роговицы глаза).

У собаки после инкубационного перио­да (14дн.) появляются возбуждение, обильное слюнотечение, рвота, водобоязнь. Она грызет место укуса, бросается на людей, животных. Через 1—3 дня наступают паралич и смерть животного.

Патогенез и клиника. Вирус, попав со слюной больного животного в поврежденные наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем возбудитель распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размно­жается. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения. Размножившийся вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период у человека при бешенстве — от 10 дней до 3 месяцев. В начале заболевания появляются недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани.

Иммунитет: Человек относительно ус­тойчив к бешенству. Постинфекционный иммунитет не изучен, так как больной обычно погибает. Введение людям, укушенным бешеным животным, инактивированной антирабической вакцины вызывает выработку антител, интерферонов и активацию клеточного иммунитета.

Микробиологическая диагностика: Постмортальная диагностика включает об­наружение телец Бабеша—Негри в мазках-отпечатках или срезах из ткани мозга, а также выделение вируса из моз­га и подчелюстных слюнных желез. Тельца Бабеша—Негри выявляют методами окраски по Романовскому—Гимзе. Вирусные антигены в клет­ках обнаруживают с помощью РИФ.

Выделяют вирус из патологического мате­риала путем биопробы на мышах: заражают интрацеребрально. Идентификацию вирусов проводят с помо­щью ИФА, а также в РН на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.

Прижизненная диагностика основана на ис­следовании: отпечатков роговицы, биоптатов кожи с помощью РИФ; выделении вируса из слюны, цереброспинальной и слезной жидкос­ти путем интрацеребрального инфицирования мышей. Возможно определение ан­тител у больных с помощью РСК, ИФА.

Лечение. Симптоматическое; эффективное лечение отсутствует.

Профилактика. Выявление, уничтожение жи­вотных. Иммунизация антирабической вакциной собак. Специфическую профилактику проводят антирабической вакциной и антирабической сывороткой или иммуноглобулином. Инактивированная УФ- или гамма лучами культуральная вакцина. С лечебно–профилактической целью иммунизируют людей; формируется активный иммунитет.