ДНК-праймаза

Инициация репликации и прерывистый синтез ДНК на отстающей цепи происходит по РНК-праймерному механизму и является универсальным свойством репликации ДНК у про- и эукариот.

ДНК-праймаза отличается от других РНК-полимераз целым рядом присущих только ей свойств. Во-первых, матричной и субстратной специфичностью. Во-вторых, необычной процессивностью - синтезом мультимеров, кратных 10-нуклеотидным звеньям. В-третьих, низкой точностью и устойчивостью к некоторым ингибиторам РНК- и ДНК-полимераз. Здесь необходимо вернуться к проблеме синтеза РНК-праймеров.

Синтез РНК-праймеров на природных матрицах начинается во множественных, но не случайных участках, его инициация происходит с АТР или GТР даже при высоких концентрациях СТР и UTР. Показано, что, например, ДНК вируса SV40 содержат предпочтительные участки инициации - З'-dСТTТ или З'-dССС, расположенные внутри участков из 7-25 пиримидиновых нуклеотидов. Высокое соотношение АТР/GТР повышает вероятность инициации в участках З'-dCТТТ, а низкое - в участках З'-dССС. Таким образом, концентрация NТР и нуклеотидная последовательность матрицы определяют участки инициации. Впрочем, участки инициации in vivoзаметно отличаются от участков инициации, используемых во время репликации ДНК SV40. Во многих случаях обнаружена последовательность 5'-YYYYYYYYСТТТYYYY-3', где Y = С или Т, которая является стартовой площадкой для инициации синтеза ДНК-праймазой в составе комплекса с ДНК-полимеразой α. Минимальная длина пиримидинового кластера должна быть не менее 7 н. Замена одного из пиримидинов на З'-конце кластера значительно понижает частоту инициации, а замены внутри и вне кластера приводят к смещению точки старта. Известно, что матрицу распознает сама ДНК-праймаза. Стартовый нуклеотид вновь синтезированного праймера всегда является пурином.

Этот комплекс имеет еще одну специфическую функцию - синтез теломерной отстающей цепи ДНК млекопитающих осуществляет ДНК-полимераза α-праймаза.

ДНК-праймаза - сравнительно медленный фермент. Средняя скорость включения NTP этим ферментом примерно на два порядка меньше, чем скорость включения dNТР ДНК-полимеразой α. ДНК-полимераза α способна удлинять праймеры длиной более 7-10 н. Продукты длиной 2-6 н. не являются субстратами ДНК-полимеразы α и называются абортивными, До синтеза РНК-праймера ДНК-полимераза α и ДНК-праймаза действуют независимо, а после этого их активности координируются. Синтезированный РНК-праймер перемещается в полимеразный активный центр без диссоциации в раствор. Это внутримолекулярное перемещение праймера в дуплексе с матрицей является быстрым и сравнимо по скорости с синтезом праймера. После того как ДНК-полимераза α удлинит праймер, праймаза начинает синтез нового праймера, и цикл повторяется. ДНК-праймаза эукариот отличается от других РНК-полимераз своей способностью к включению дезоксирибонуклеотида в праймер, таким же свойством обладает и праймаза прокариот. Одним из возможных объяснений необходимости включения dNТР в З'-конец праймера является необходимость перехода от А-формы к В-форме ДНК. Поэтому понимание механизма "переключения" комплекса ДНК-полимеразы α-праймазы от синтеза РНК к ДНК имеет очень большое значение. Способность праймазы узнавать одновременно и рибо-, и дезоксириботрифосфаты представляет серьезный научный интерес.

Выбор РНК-праймера определяется гидрофобным характером белково-нуклеиновых взаимодействий. В случае гибрида РНК-ДНК дуплекс находится в А-форме, в которой обеспечивается оптимальный баланс между гидрофобными и комплементарными взаимодействиями оснований матрицы и праймера.

После инициации рост праймера сопровождается извлечением оснований матрицы из гидрофобной полости белка для спаривания с основаниями растущей цепи РНК. В условиях такой конкуренции короткие ди- и тринуклеотиды легко диссоциируют, образуя абортивные продукты. С ростом длины праймера прочность дуплекса увеличивается, ослабевает влияние гидрофобности активного центра, и пары оснований приближаются к оси спирали. При длине праймера 7 н. создаются условия для включения дезоксинуклеотида и перехода в В-форму, которая энергетически более выгодна. Здесь нужно учитывать и большее сродство к ферменту dNТР по сравнению с NТР. Предложенная концепция, по-видимому, носит универсальный характер, поскольку подобное происходит и при инициации транскрипции. Только в этом случае абортивный синтез транскриптов переключается на высокопроцессивный синтез.

выбор РНК-праймера

ДНК-полимераза α связывает сначала матрицу, затем праймер и субстрат. ДНК-полимераза α наиболее активна на двунитевой ДНК, содержащей бреши длиной не менее 20-30 н.

Область связывания матрицы с ДНК-полимеразой α является достаточно протяженной. Она строго защищает от гидролиза 9 н. праймерной цепи, 13 н. двухцепочечного участка и 14 н. одноцепочечной матрицы и слабо защищает несколько оснований вне этого района. Фермент связывается с 19-20 н. матрицы посредством ионных и гидрофобных взаимодействий, эффективность связывания при этом коррелирует с гидрофобностью оснований матрицы.

Отличительной особенностью ДНК-полимеразы α является ее способность удлинять РНК-праймеры и прочная ассоциация с ДНК-праймазой, которая синтезирует эти праймеры.

Средняя процессивность ДНК-полимеразы α составляет 20-50 н. Праймаза редко ошибается в момент синтеза динуклеотида, но затем легко использует неправильные NТР. Хотя скорость включения ошибочных нуклеотидов зависит от нуклеотидной последовательности матрицы и самого неправильного нуклеотида, в принципе, ДНК-праймаза является самым неточным нуклеотид-полимеризующим ферментом. В некоторых случаях один неправильный нуклеотид приходится менее чем на 100 правильных. Встраивание неправильного нуклеотида не препятствует включению следующего правильного нуклеотида. Праймаза может полимеризовать сходные нуклеотиды и генерировать праймеры с множественными ошибками, котрые не ингибируют дальнейший синтез и после внутримолекулярного переноса в ДНК-полимеразный активный центр удлиняются ДНК-полимеразой в присутствии dNTP.

Существуют две модели механизма синтеза праймеров, некомплементарных матрице. Согласно первой модели, фермент просто включает некомплементарные матрице нуклеотиды. Вторая модель предполагает включение нуклеотида, комплементарного матрице, с последующим скольжением праймера относительно матрицы. Низкая точность ДНК-праймазы послужила основой гипотезы о том. почему именно РНК является затравкой при репликации ДНК. Поскольку первые нуклеотиды могут ошибочно включаться в новую растущую цепь, предполагается, что РНК-праймер отмечает "высокоошибочный" участок для последующего вырезания и более точной застройки. Эта точка зрения выглядит убедительной, но, вероятно, главная причина появления РНК-праймера связана с более эффективной инициацией синтеза ДНК.

В отличие от праймазы ДНК-полимераза α является достаточно точным ферментом. Она делает в среднем от 1/30 000 до 1/50 000 ошибок. Важную роль в обеспечении специфичности синтеза играют белковые факторы репликации. В присутствии RРА точность ДНК-полимеразы α повышается. Известно, что различие свободных энергий образования правильных и неправильных пар оснований в активном центре полимеразы, по-видимому, в 10 раз больше, чем в водной среде.

Выделенные из клеток высокомолекулярные формы ДНК-полимеразы α могут обладать другими активностями помимо ДНК-полимеразной и праймазной. Эти комплексы представляют собой фрагменты репликативной машины клеток. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей нити, ДНК-полимераза α связана с ДНК-полимеразой δ, а в комплексе, синтезирующем запаздывающую цепь, - с ДНК-полимеразой ε. У эукариот оба комплекса связаны, вероятно, друг с другом в репликативной вилке подобно тому, как связаны холоферменты синтеза лидирующей и запаздывающей нити у прокариот. Об этом свидетельствует выделение из клеток человека комплексов, названных синтесомами и содержащих ДНК-полимеразы α, δ и ε, а также ряд других репликативных белков, среди которых ДНК-праймаза, репликативный фактор RFC, РСNА, поли(АDР-рибозо)-полимераза и ДНК-лигаза I. Из этого высокомолекулярного комплекса недавно выделены и охарактеризованы ДНК-геликаза А с молекулярной массой 90 кДа и 5' → З'-экзонуклеаза с мол. массой 47 кДа. С ДНК-полимеразой α может быть также связан белок Р1 из клеток мыши, являющийся гомологом белка МсмЗ дрожжей.

Комплекс ДНК-полимераза α-праймаза в ходе мейоза диссоциирует.

Большой Т-антиген SV40 (и других паповавирусов) взаимодействует с субъединицами р 180 и р70 в комплексе ДНК-полимераза α-праймаза и рекрутирует этот комплекс в ori вируса. При репликации вируса папилломы ДНК-полимераза α связана с вирусной геликазой Е1.

Негативная регуляция комплекса в клеточном цикле зависит не только от фосфорилирования р180, но также от фосфорилирования субъединицы р68 циклин А-зависимыми киназами. В клетках дрожжей комплекс ДНК-полимераза α-праймаза связан с хроматином в фазах G1 и S клеточного цикла, но не G2/М. Связывание с хроматином зависит от дефосфорилирования субъединицы 86 кДа (гомолог р70) в конце митоза.

ДНК-полимеразы δ и ε.

ДНК-полимераза δ представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы с мол. массой 125-130 кДа и субъединицы 48-55 кДа, необходимой для связывания с фактором процессивности РСNА. Малая субъединица нужна для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах. В действительности нативный фермент может представлять собой тетрамер, содержащий по две субъединицы с мол. массами 125 и 55 кДа, а субъединица 55 кДа является фактором димеризации репликативных холоферментов, подобно субъединице τ в ДНК-полимеразе III Е. соli. В отсутствие РСNА ДНК-полимераза δ имеет низкую процессивность на длинных однонитевых матрицах, и только в присутствии РСNA процессивность возрастает в 10-100 раз. С помощью делеционных мутантов установлено, что в ДНК-полимеразе δ мыши за связывание РСNА ответствен участок 129-149 аминокислотных остатков N-концевой области каталитического полипептида, С-концевой домен менее консервативен и содержит два участка связывания ДНК.

Холофермент ДНК-полимеразы δ включает в себя фактор процессивности РСNА и факторы RFС и RРА, он собирается на праймер-матричном комплексе в следующем порядке: сначала RFС связывается с З'-ОН-концом праймера на однонитевой ДНК-матрице, "покрытой" белком RРА. Затем RFС в присутствии АТР формирует на ДНК-дуплексе, прилежащем к З'-концу праймера, кольцевую структуру из трех молекул РСNА с мол. массой 36 кДа, а РCNA обеспечивает присоединение ДНК-полимеразы δ к З'-концу праймера, завершая таким образом формирование высокопроцессивного холофермента.

B самом РСNА идентифицированы участки, отвечающие за связывание с субъединицами RFС и ДНК-полимеразами. В присоединении к ДНК у полимеразы δ участвуют аминокислотные остатки 121-135, образующие петлю между доменами РСNА.

3' —- 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ также регулируется факторами, входящими в состав холофермента. В отсутствие вспомогательных факторов 3' —- 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы δ низка, но в присутствии белка RРА, как и ДНК-полимеразы α, она возрастает в 8-10 раз. Активирующий эффект RРА на 3' →5'-экзонуклеазную активность обусловлен, очевидно, дестабилизацией комплекса затравки с матрицей в присутствии этого белкового комплекса.

Синтез ДНК-полимеразы δ в клеточном цикле регулируется на уровне транскрипции. Количество мРНК фермента и белка достигает максимума на границе G1/S-фаз. Динамика синтеза ДНК-полимеразы δ в цикле соответствует динамике ДНК-полимеразы α. Интересно, что синтез РСNА в ходе клеточного цикла коррелирует с синтезом ДНК-полимеразы δ, однако содержание РСNА стабильно увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. ДНК-полимераза δ представляет собой фосфобелок, наибольшая степень фосфорилирования которого относится к фазе S. Фосфорилирование каталитической субъединицы 125 кДа ДНК-полимеразы δ осуществляется, очевидно, специфичной для фазы G1 циклин-зависимой протеинкиназой сdk2. Интересно, что фосфорилирование каталитической субъединицы не сказывается на ее ферментативной активности.

ДНК-полимераза ε человека содержит два полипептида - каталитический 261 кДа и полипептид 55 кДа. ДНК-полимераза ε дрожжей состоит из пяти субъединиц - каталитической 256 кДа и субъединиц 80, 34, 31 и 29 кДа. Субъединица 80 кДа ДНК-полимеразы ε дрожжей является гомологом субъединицы 55 кДа фермента из клеток млекопитающих. Ферментативные активности - ДНК-полимеразная и 3' →5'-экзонуклеазная - связаны с высокомолекулярным полипептидом, N-концевой домен которого обеспечивает обе активности, а С-концевой домен необходим для контроля вступления клетки в S-фазу цикла.

Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ε является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов РСNА, RFС и RРА по сравнению с холоферментом ДНК-полимеразы δ. ДНК-полимераза ε способна процессивно удлинять затравку на однонитевых матрицах в отсутствие РСNА. В присутствии полного набора репликативных факторов увеличивается процессивность синтеза и эффективность связывания ДНК-полимеразы ε с праймерами. Существует представление, что на ДНК-матрицах, покрытых белком RРА, факторы РСNА, RFС и АТР образуют «комплекс узнавания З'-ОН-конца праймера». Участок связывания ДНК-полимеразы ε в молекуле РСNА не совпадает с участком связывания ДНК-полимеразы δ. Об этом свидетельствует тот факт, что разные мутантные формы белка PCNA - рсnа-79 и рсnа-90 - не способны взаимодействовать с ДНК-полимеразами δ и ε соответственно. В результате у мутанта рсnа-79 нарушен синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой δ, а у мутанта рсnа-90 - ДНК-полимеразой ε.

Другое различие между холоферментами ДНК-полимераз δ и ε заключается в разной скорости синтеза ДНК. В оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом ДНК-полимеразы ε примерно на порядок ниже скорости синтеза холоферментом ДНК-полимеразы δ. Это различие связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент ДНК-полимеразы δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственный праймеру, синтезируемый в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, а несколько холоферментов ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагменты Оказаки в "зоне Оказаки", удлиняя прамеры, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого фрагмента. При этом должен происходить быстрый оборот ДНК-полимеразы ε, сопровождающийся диссоциацией после завершения синтеза фрагмента и ассоциацией с праймером очередного фрагмента. При синтезе фрагментов запаздывающей цепи, когда концентрация праймеров высока и могут синтезироваться одновременно несколько фрагментов, высокая скорость полимеризации не столь важна, как спосбность к быстрому переключению с одного фрагмента Оказаки к другому.

Содержание мРНК ДНК-полимеразы ε в клеточном цикле изменяется, достигая своего максимума непосредственно перед клеточным делением. Уровень этой мРНК в пролиферирующих клетках в 5-16 раз выше, чем в покоящихся.

ДНК-полимеразы, δ и ε, обладают 3' → 5'-экзо-нуклеазной активностью, выполняющей корректорскую функцию в ходе синтеза ДНК, но частоты ошибок при синтезе лидирующей и запаздывающей нитей отличаются. Это связано с тем, что часть ДНК отстающей нити синтезируется ДНК-полимеразой α, которая способна синтезировать ДНК с большим количеством ошибок.

ДНК-полимераза γ

Эта полимераза локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией мтДНК. ДНК-полимеразы у представляют собой гетеродимеры, состоящие из большой каталитической субъединицы 125-140 кДа, обладающей ДНК-полимеразной и З¹ →5'-экзо-нуклеазной активностью, и вспомогательной субъединицы 35-50 кДа, функция которой неизвестна. Как и другие ферменты репликации мтДНК, ДНК-полимераза γ кодируется ядерным геномом. Первичная структура ДНК-полимеразы γ сходна со структурой ДНК-полимеразы I Е. соli, особенно в области каталитических центров, в N-концевом 3' -→ 5'-экзонуклеазном домене и С-концевом полимеразном домене.

ДНК-полимераза β

ДНК-полимераза β является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. В силу этого она наиболее изучена. Выделенный из клеток позвоночных фермент представляет собой один каталитически активный полипептид из 334 или 335 аминокислотных остатков с молекулярной массой 39-40 кДа. По своему строению ДНК-полимераза β ближе к семейству нуклеотидилтрансфераз, чем к α-семейству ДНК-полимераз.

ДНК-полимераза β обладает двумя ферментативными активностями - ДНК-полимеразной (5¹ → З'-дезоксинуклеотидилтрансферазной) и дезоксирибофосфатлиазной (dRp- или АР-лиазной), удаляющей 5'-концевые апуриновые/апиримидиновые остатки (АР-сайты), ограничивающие бреши в ДНК, по механизму β –элиминации.

Мягкий протеолиз ДНК-полимеразы β приводит к образованию N-концевого домена 8 кДа и С-концевого домена 31 кДа. Дальнейший протеолиз домена 31 кДа расщепляет его на домены с мол. массами 6, 10 и 12 кДа, расположенные последовательно от N- к С-концу. В домене 8 кДа находятся участки связывания фермента с однонитевой и двунитевой ДНК, каталитический дезоксирибофосфатлиазный центр и участок связывания 5'-фосфата, ограничивающего однонитевую брешь. Для дезоксирибофосфатлиазного центра характерна Lys-богатая область, аминокислотные остатки которой His-34, Lys-35, Lys-68 и Lys-72 непосредственно участвуют в высвобождении dRр. Lys-35 участвует в узнавании 5'-фосфата. а Lys-72 выступает нуклеофилом при β -элиминации в ходе dRp-лиазной реакции. Замена Lys-72 на Arg не влияет на ДНК-связывающую и полимеразную активности фермента, но нарушает способность к репарации АР-сайтов. ДНК-полимеразная активность фермента локализована в двух С-концевых доменах. Каталитический нуклеотидилтрансферазный центр расположен в домене 10 кДа и включает Asp-190 и Asp-192. В связывании атомов двухвалентных металлов участвуют Asp-256 и Агg-254, а в связывании dNТР - аминокислотные остатки 4-40 домена 8 кДа и аминокислотные остатки 263-283 домена 12 кДа. Замена одного аминокислотного остатка в этом районе (Туr-265) приводит к появлению мутаторной формы фермента. В ходе каталитической реакции фермент способен менять конформацию и изгибать матричную ДНК под углом 90° в месте бреши.

Уровень активности ДНК-полимеразы β не меняется на протяжении клеточного цикла. Однако в присутствии агентов, повреждающих геномную ДНК, может наблюдаться индукция этого фермента, что согласуется с репаративной функцией ДНК-полимеразы β.