Теломеры и репарация

Теломеры являются единственными «легально разрешенными» двунитевыми разрывами ДНК в клетке.

Двунитевые разрывы ДНК (DSB, double-strand breaks) происходят под действием ионизирующей радиации и некоторых других повреждающих агентов. Известны два оснвных пути репарации DSB: гомологическая рекомбинация и достраивание недостающих цепей и негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ, Non-homologous end joining). Считают, что первый путь преобладает в S и G2 фазах клеточного цикла и у активно делящихся клеток, например дрожжей, а второй — в G0/G1 фазах и у редко делящихся клеток, в частности клеток млекопитающих. С другой стороны, показано, что разрывы геномной ДНК могут активно стимулировать гомологичную рекомбинацию в клетках млекопитающих.

Независимо от механизмов репарации, и DSB, и незащищенные теломеры активируют протеинкиназу АТМ, что приводит, как уже отмечалось выше, к активации р53 и далее - к блокированию пролиферации, индукции механизмов клеточного старения и апоптоза. Когда же образуется t-петля, однонитевой участок теломер, спаривающийся со «стволом», имитирует гомологичную рекомбинацию и при определенных условиях может стимулировать достраивание новой цепи ДНК. По этому принципу происходит удлинение еломер, независимое от теломеразы.

В составе теломерного нуклеопротеилного комплекса как у дрожжей, так и в клетках человека постоянно присутствует белок Кu, один из компонентов пути NHEJ. Гетеродимер Кu человека состоит из субъединицмолекулярной массой 69 и 83 кДа, называемых Кu70 и Кu80 (или Кu86). У дрожжей гомологичные белки называются HDF1 (или yКu70) и НDF2 (соответственно, уКu80). Он связывает разрывы в ДНК не только теломерной, но и любой другой последовательности, как одно-, так и двунитевые, и предположительно препятствует дальнейшей деградации ДНК.

Участие Кu в функционировании теломер изучается не столь давно, но также неоднократно отмечалось в разных лабораториях. Противоречие между ролью Кu в репарации DSВ и участием этого белка в защите теломер, в том числе от слияний, достаточно очевидно, поскольку это два прямо противоположных процесса. Вероятно, Кu выполняет во всех случаях лишь защитные функции, а дальнейшие процессы происходят при участии специфических для них белков, т.е. либо TRF, либо систем репарации и рекомбинации. В частности, на теломерах Кu ингибирует деградацию и рекомбинацию теломерных повторов. При недостатке этого белка теломеры укорачиваются; в участках генома, прилегающих к концам хромосом, активность которых в норме подавлена, инициируются перестановки последовательностей. К сожалению, единого мнения по вопросу о роли белка Кu в телосоме пока нет.

После связывания белка Кu на DSВ и активации DNА-РК в репарации участвует еще множество белков. Среди них комплекс Rad50/Mre11/NBS1. Кроме NHEJ эти белки участвуют также в гомологичной рекомбинации и в поддержании целостности теломер.

Белок Rad50 (Radiation mutant 50) первоначально изучали на дрожжах, однако в 90-х годах был найден его гомолог и у человека. Rad50 - вытянутая палочкообразная молекула, напоминающая миозин. Молекулярная масса ортологов у дрожжей и человека — 153 кДа. Полипептид имеет два ДНК-связываюших домена, расположенных на N- и С-концах молекулы и проявляющих ферментативную АТРазную активность. Это наиболее консервативные по аминокислотной последовательности участки молекулы, идентичные у дрожжей и человека на 50% и более. Энзиматические домены соединены протяженным суперспирализованным участком, изогнутым под острым углом в районе Zn-связываюшего мотива, расположенного в центре молекулы, так что ДНК-связываюшие домены колокализованы. Zn-cвязываюший домен служит для димеризации Rad50, так что димер из двух палочковидных молекул может одновременно удерживать молекулы ДНК, расположенные на расстоянии до 1200Å. Mre11 (meiotic recombination 11) — нуклеаза, которая также изучалась на дрожжах, и го­мологи которой присутствуют во всех царствах, включая животных и человека. При репарации Mre11 подвергает деградации шпильки и прочие неправильные структуры в молекуле ДНК, в частности, образующиеся в поврежденных вилках репликации. При гомологичной рекомбинации нуклеазная активность необходима для спаривания двух молекул ДНК, в котором участвуют З'-концевые однонитевые участки протяженностью в несколько сотен пар нуклеотидов. Комплекс Rad50/Мrе11, в котором Мге11 связывается в районе АТРазного домена Rad50, проявляет эндонуклеазную, а также экзонуклеазную активность в направлении от 3'- к 5'-концу ДНК, но не в обратном направлении. Очевидно, Мre11 - не единственная нуклеаза, участвующая в катализе рекомбинации. Некоторые мутации Мre11, приводящие к блокированию взаимодействия с Rad50, сопровождаются укорочением теломер, не нарушая при этом процессы репарации; другие, напротив, снижают энзиматнческую активность белка, но не влияют на его участие в защите теломер. Следовательно, функции этого белка в репарации и в поддержании структуры теломер не идентичны.

Третий компонент комплекса не гомологичен у дрожжей и человека. У S. сеreviseае это белок Хгs2, а у человека -- нибрин или Nbs1) (Nijmegen breakage syndrome 1), белок, мутация которого на клеточном уровне приводит к изменениям, сходным с вызванными мутацией АТМ, хотя клиническая картина соответствующего наследственного заболевания в двух указанных случаях различается. NBS1 модулирует энзиматическую активность Rad50 и Мге11, а также придает комплексу способность в присутствии АТР раскручивать двунитевуюДНК.

Функции белков, связанных с теломерами.

Нередко трудно понять даже, действительно ли тот или иной белок важен для теломер и играет какую-то роль в их защите, репликации, репарации или передаче сигнала о их состоянии к каким-то еще субклеточным структурам, либо он не проявляет специфичности к теломерам. а его активность в отношении ДНК не связана с особенностям нуклеотидной последовательности. Так, например, обстоит дело с белками репарации, которые выявляют, разумеется, не только на теломерах; из них Кu и комплекс Rad50/Мге11/NBS1 считают постоянно присутствующими в составе телосомы. в то время как к другим участкам ДНК они транслоиируются по мере необходимости. Среди белков такого рода можно также упомянуть UP1, который считают участвующим в поддержании структуры теломер и некоторых других G-богатых участков ДНК.

Тем не менее, белки, связанные с теломерами, можно разделить по функциональному признаку на следуюшие группы.

Во-первых, это белки, поддерживающие пространственную структуру теломер. К ним, в частности, относится семейство TRF и другие белки с телобоксом.

Во-вторых, белки, которые обеспечивают и регулируют образование теломерного гетерохроматина, а также модулируют активность генов, прилегающих к теломерам, путем их включения в гетерохроматин. К этой группе отнесем белки Rap, Sir, а также Rif. гистоновые ацетилазы, метилтрансферазы и др.

В-третьих, белки, отвечающие за подготовку теломер к репликации и взаимодействию с теломеразой. Сюда относятся танкираза, а также белки, регулирующие непосредственно теломеразу, такие как РinX1 и некоторые другие, например, комплекс Stn1/Сdс13/Ten1 у дрожжей.

В-четвертых, белки, осуществляющие репарацию повреждений теломер, а также, возможно, негативно регулирующие их длину, т.е. нуклеазы. В качестве примера можно привести Rad50/Мге11/NBS1 и Кu.

Наконец, пятая группа - сигнальные белки, передающие информацию о защите или повреждениях теломер в другие субклеточные компартменты, а также инициирующие клеточное старение и апоптоз. Это протеинкиназа АТМ, р53, р16INК4, рRb и другие белки сигнальных путей, регулирующих пролиферацию и отмирание клеток.

Разумеется, распределение собственно теломерных и ассоциированных с теломерами белков по указанным группам не исключает их участия в нескольких различных механизмах, изучение которых еще продолжается.