Определение мальтазной активности

Определение мальтазной активности проводят поляриметрическим методом.

Метод основан на определении скорости гидролиза мальтозы ферментом α-глюкозидазой комплекса дрожжей, которая измеряется поляриметрически по изменению угла поворота плоскости поляризации реакционной среды до и после действия ферментов на субстрат. За единицу активности α-глюкозидазы принимается такое количество фермента, которое гидролизует 1 Моль мальтозы при температуре 35 ⁰С и рН 6,8 в течение 1 мин.

Приборы и оборудование: весы технические, поляриметр, термостат

Посуда и материалы: пробирки, термометр, мерный цилиндр на 200 см³, фарфоровая чашка, стеклянная воронка, фильтровальная бумага.

Реактивы: 5 %-ныйзабуференный раствор мальтозы – 30 см³, раствор НС1 концентрацией 5 моль/дм³ – 5 см³, 30 %-ный раствор сернокислого цинка – 5 см³, 15 %-ного раствора железосинеродистого калия – 5 см³

Расход сырья: дрожжи хлебопекарные – 5 г

Техника определения

Навеску дрожжей массой 5 г перемешивают со 150 см³ дистиллированной воды до получения однородной суспензии. Эту суспензию используют для анализа.

В пробирку вносят 15 см³забуференного раствора субстрата (5 %-ныйзабуференный раствор мольтозы) и помещают в термостат или водяную баню с температурой 35 ⁰С на 10 мин. Затем к содержимому пробирки добавляют 15 см³ исследуемого раствора дрожжей, быстро перемешивают и выдерживают в термостате для протекания реакции 60 мин при температуре 35 ⁰С.

После выдержки ферментативную реакцию останавливают добавлением 1 см³ раствора НС1 концентрацией 5 моль/дм³. Затем в пробирку добавляют по 1 см³осадителей (30 %-ный раствор сернокислого цинка и 15 %-ного раствора железосинеродистого калия) для осаждения белков и осветления раствора. Содержимое пробирок перемешивают, охлаждают до 20 ⁰С и фильтруют.

Одновременно с опытом готовят контроль. Для этого в пробирку с 15 см³ исследуемого раствора дрожжей приливают сначала 1 см³ раствора НС1 концентрацией 5 моль/дм³, затем по 1 см³осадителей и 15 см³ субстрата. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. В опытном и контрольном растворах определяют угол поворота плоскости поляризации на поляриметре с линейной или круговой шкалой (в последнем случае измеренные величины поляризации следует умножить на коэффициент 2,8885) для перевода круговых градусов в градусы нормальной сахарной шкалы.

Расчет мальтазной активности дрожжей (МС_п, ед/г) проводят по формуле 6.5.

МС_п = (6.5)

где: 0,0438 – количество глюкозы, образующейся при гидролизе

мальтозы в условиях разработанного метода в 1 см³

инкубационной смеси, соответствующее изменению

поляризации, равному 1⁰, г;

ΔП – изменение угла плоскости поляризации, равное разности

поляризации контрольного и опытного растворов, ⁰С;

60 – время действия фермента, мин;

342 – молекулярная масса мальтозы (для перевода мкг в ммоль), г;

а – количество дрожжей в инкубационной смеси, г.

Дрожжи считаются неудовлетворительного качества, если МС_п≤ 2 ед/г, удовлетворительного – от 2 до 4 ед/г; хорошего качества – при активности от 4 до 8 ед/г и отличного – при мальтазной активности – более 8 ед/г.