Вирус гепатита d (гепатит дельта)

Методические указания для студентов к практическому занятию № 11.

 

Тема: Лабораторная диагностика вирусных гепатитов.

Цель: Изучение методов лабораторной диагностики вирусных гепатитов.

Модуль 3. Общая и специальная вирусология.

Содержательный модуль 14.

Специальная вирусология.

Тема 11: Лабораторная диагностика вирусных гепатитов.

Актуальность темы: На долю вирусных гепатитов в Украине выпадает приблизительно 20% всех вирусных заболеваний, которые приводят к продолжительной потере трудоспособности: острые некрозы печени, циррозы, первичный рак печени. Вирус гепатита А вызывает эпидемический гепатит (инфекционную эпидемическую желтуху, болезнь Боткина). За морфологическими и физико-химическими характеристиками похожий на ентеровирусы. Вирус гепатита В описанный в 1970 г. и получивший название частицы Дейна. Это сложный вирус, который содержит ДНК. Вызывает сывороточный гепатит. За последние годы наблюдается рост заболеваемости этой формой гепатита.

ВИРУС ГЕПАТИТА А.

Гепатит А (болезнь Боткина) – инфекционное заболевание с фекально-оральным путем передачи, клинически и морфологически характеризующееся поражением печени с развитием симптомокомплекса острого гепатита. Заболевание известно с глубокой древности, его описание содержат труды Гиппократа. Вирус впервые выделил С. Фейстоун (1973).

Таксономия. В настоящее время вирус гепатита А включен в род Hepatovirus семейства Picornaviridae.

Морфология. Зрелые вирионы сферической формы имеют размер 25-27 нм. Геном образует несегментированная молекула +РНК. Нуклеокапсид организован по типу кубической симметрии: образован капсомерами, состоящими из четырех белков (VP_1-4). Суперкапсид отсутствует.

Антигенная структура. Возбудитель представлен одним антигенным типом и содержит главный Ar(HA-Ar),по которому его идентифицируют.

Эпидемиология. Резервуар возбудителя - больной человек. Больной выделяет возбудитель в течении 2-3 недель до начала и в течение первых 3-5 суток желтушного периода. Передача возбудителя происходит фекально-оральным путем (через воду, пищевые продукты, грязные руки, различные предметы). Вирус гепатита А устойчив в окружающей среде, при 21⁰С сохраняется несколько недель, полностью инактивируется при температуре 85⁰С. Вирус хорошо переносит низкие температуры, устойчив к хлору, благодаря чему сохраняется в очищенной пищевой воде. Фекальное загрязнение источников водопользования может вызвать формирование эпидемических вспышек. Пик заболеваемости приходится на холодный сезон (поздняя осень или зима). После перенесенного заболевания формируется стойкая невосприимчивость к повторным заражениям.

Патогенез. Попадая в организм с водой или пищей, вирус гепатита А размножается в эпителии слизистой оболочки тонкой кишки и регионарных лимфоидных тканях. Затем наступает фаза кратковременной вирусемии. Максимальная концентрация вируса в крови возникает в конце инкубационного периода и в преджелтушном периоде. В это время возбудитель выделяется с фекалиями. Основная мишень для цитопатогенного действия-гепатоциты. Репродукция вируса в их цитоплазме приводит к гибели клеток. Цитопатический эффект усиливают иммунные механизмы, в частности NK-клетки, активированные ИФН, синтез которого индуцируется вирусом.

Принципы микробиологической диагностики. Маркеры репликации вируса - АТ (IgM и IgG) к Аг вируса гепатита А и вирусная РНК. Указанные маркеры определяют в ИФА и РИА. Выявление Аг вируса гепатита А в фекалиях имеет ограниченное значение, так как пик его образования приходится на инкубационный и начало желтушного периодов. Выявление Аг вируса гепатита А можно использовать для эпидемиологического обследования контактных лиц. К заражению вирусом гепатита А чувствительны приматы, но в широкой клинической практике данный метод диагностики не используют. Монослойные культуры клеток нечувствительны к вирусу гепатита А, и для выделения возбудителя предпочтительнее использовать лейкоцитарные или органные культуры. Вирус отличает слабый цитопатический эффект.

Лечение и профилактика. Средства специфической противовирусной химиотерапии отсутствуют, лечение симптоматическое. Разработанный сывороточный Ig предупреждает развитие заболевания в течение 3 месяцев, но также значительно смягчает течение заболевания. Его применяют для пассивной иммунизации лиц, направляющихся в эндемичные районы. Для активной иммунопрофилактики вирусного гепатита А используют убитые и рекомбинантные вакцины. Общие профилактические мероприятия направлены на улучшение санитарной обстановки, включают соблюдение карантинных мероприятий, улучшение условий водоснабжения и повышение гигиенической культуры населения.

ВИРУС ГЕПАТИТА В

Гепатит В – инфекционное заболевание с кровяно-контактным механизмом передачи, клинически и морфологически характеризующиеся поражением печени с развитием симптомокомплекса острого и хронического гепатита. Возбудитель впервые обнаружил Д. Дейн и соавт. (1970).

Таксономия. Вирус гепатита В включен в состав рода Orthohepadnavirus семейства Hepadnaviridae.

Морфология. Вирионы вируса гепатита В сферической формы 42 нм в диаметре имеют суперкапсид. Геном образует неполная (одна нить короче) двухнитевая кольцевая молекула ДНК. С короткой “плюс”-нитью ДНК связан праймерный белок. В состав сердцевины также входит ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Для эффективной репродукции необходим синтез ДНК-полимеразы, так как вирусная ДНК образуется на матрице РНК; в динамике процесса вирусная ДНК интегрирует в ДНК клетки. В крови больных гепатитом В циркулируют частицы трех морфологических типов. Наиболее часто обнаруживают сферические частицы около 22 нм в диаметре; реже - нитевидные формы около 22 нм в диаметре и 50-230 нм в длину. Вирусные частицы этих типов не проявляют инфекционных свойств. Лишь 7% частиц представлены комплексными двухслойными сферическими образованиями с полной структурой - частицы Дейна, проявляющие выраженную инфекционность. Их оболочку на 70% поверхности образуют белки.

Антигенная структура. Основные Ar частиц Дейна – поверхностный HBsAg и сердцевинный HBcAg. АТ против HBsAg и HBcAg появляются в течении заболевания. Наличие АТ против HBsAg прямо связано с невосприимчивостью к инфекции (постинфекционный или поствакцинальный иммунитет).

HВsAg. Первый идентифицированный Ar вируса гепатита В; впервые его выделил Б. Блюмберг (1965) из крови австралийского аборигена, поэтому этот Ar также называют австралийским. HВsAg часто образует дефектные морфологические частицы 1-го типа, лишенные инфекционных свойств (побочные метаболиты репликативного цикла). В цитоплазме зараженных клеток возникает излишек HВsAg, связанного с клеточной мембраной и эндоплазматическим ретикулумом. HВsAg появляется в крови через 1,5 месяца после инфицирования; постоянно циркулирует в сыворотке инфицированных лиц, а его очищенные агрегаты входят в состав вакцины против вируса гепатита В. HВsAg включает два полипептидных фрагмента: preS₁ обладает выраженными иммуногенными свойствами (рекомбинантный продукт можно использовать для приготовления вакцинных препаратов); preS₂ – полиглобулиновый рецептор, приводящий к адсорбции вируса на гепатоцитах.

HВcAg. Сердцевинный HВcAg представлен единственным антигенным типом; его обнаруживают только в сердцевине частиц Дейна. Ar маркирует репликацию вируса в гепатоцитах. Может быть обнаружен только при морфологическом исследовании биоптатов или аутопсийного материала печени. В крови в свободном виде его не определяют. Точечные мутации в участке, кодирующем синтез предшественника HВcAg HВ_cAg продуцирующих мутантов вируса гепатита В, первоначально выделенных при молниеносных формах гепатита. Переход от HвcAg⁺ в HвcAg^- – формы наблюдают у пациентов с хроническими, сравнительно умеренными поражениями.

HВеAg. Не входит в состав частиц Дейна, но связи с ними, так как появляется в сыворотке в инкубационном периоде, сразу после появления HВsAg. Образование HВеAg транслируется, РНК содержащей участки сердцевинного Ar и его предшественника. После завершения трансляции образующаяся молекула HВеAg выводится из клетки. Функции HВеAg неизвестны, тем не менее HВеAg можно расценивать как наиболее чувствительный диагностический показатель активной инфекции. Обнаружение HВеAg у пациентов с хроническим гепетитом указывает на активацию процесса, что представляет высокую эпидемическую опасность. Ar может отсутствовать при инфекции, вызванной мутантным штаммом вируса.

HВхAg – наименее изученный Ar. Предположительно опосредует злокачественную трансформацию клеток печени.

ДНК появляется в сыворотке одновременно с другими Ar вируса. Исчезает из кровотока в начале второй недели острого заболевания. Длительное персистирование – свидетельство хронической инфекции. В диагностике острого гепатита В определение ДНК используют редко.

Эпидемиология. Резервуар возбудителя - инфицированный человек. Механизм передачи инфекции - кровяно-контактный. Основные пути передачи вируса гепатита В - инъекционный, гемотрансфузионный и половой. Также показана возможность вертикальной передачи вируса гепатита В от матери к плоду. 7-10% инфицированных становятся хроническими носителями. Ежегодно заболевает не менее 50 человек. В России отмечают 10-15% рост заболеваемости. Основные группы риска – медицинские работники;

• лица получающие гемотрансфузии или препараты крови;
• наркоманы, вводящие наркотики внутривенно;
• больные гемофилией;
• лица, находящиеся на гемодиализе;
• дети матерей-носителей HВsAg;
• половые партнеры носителей вируса.

Патогенез. Вирус гепатита В гематогенно заносится в печень и размножается в гепатоцитах. Во второй половине инкубационного периода (40-180сут) вирус выделяют из крови, спермы, мочи, фекалий и секрета носоглотки. В патогенезе поражений важную роль играют аутоиммунные гуморальные и клеточные реакции, что подтверждает связь между началом клинических проявлений и появлением специфических АТ. Патологический процесс начинается после распознавания вирусиндуцированных Ar на мембранах гепатоцитов иммунокомпетентными клетками. Осложнения хронической формы обусловлены хроническим воспалением и некротическими процессами в паренхиме печени, основные осложнения – цирроз и первичная карцинома печени.

Цирроз обычно отмечают у страдающих острым хроническим гепатитом,ежегодно регистрируют более 10000 летальных исходов, обусловленных вирусным гепатитом В.

Карцинома печени. Показана четкая связь между злокачестввенной трансформацией гепатоцитов и перенесенным вирусным гепатитом В. В развитии опухолевого процесса принимают участие определенные кофакторы, многие из которых остаются неизвестными.

Принципы микробиологической диагностики. Маркеры репликации вируса гепатита В – HВеAg. АТ (IgM) к HВсAg, ДНК вируса и вирусная ДНК-полимераза. Для выявления HВsAg и HВеAg применяют ИФА и РНГА; исследования дополняют выявлением ДНК вируса гепатита В и вирусной ДНК-полимеразы. Вирусоспецифические АТ к HВsAg, HВсAg, HВеAg определяют в ИФА и РНГА. На наличие “свежей” инфекции указывают высокие титры HВsAg, IgM к HВsAg и HВsAg. У пациентов с клинически проявляющимся гепатитом титр HвsAg сначала растет, а затем (по мере развитияиммунных реакций) снижается. АТ к HВsAg можно выявить только через несколько недель, что объясняют их активным связыванием в иммунные комплексы. В течение этого периода (так называемого “окна”) можно обнаружить лишь АТ к HВсAg.

АТ к HВсAg. Важный диагностический маркер инфицирования, особенно при отрицательных результатах выявления HВsAg.

· IgM к HВсAg. Один из наиболее ранних сывороточных маркеров вирусного гепатита В. При хроническом гепатите маркируют репликацию вируса и активность процесса в печени. Их исчезновение является показателем либо санации организма от возбудителя, либо развития интегративной фазы инфекции.

· IgG к HВcAg. Сохраняются многие годы. Свидетельствуют об имеющейся или ранее перенесенной инфекции.

АТ к HВеAg. Серологический маркер интеграции вируса. В комплексе с IgG HВсAg и HВsAg свидетельствуют о полном завершении инфекционного процесса.

АТ к HВsAg. Протективные АТ; также образуют после вакцинации. Применительно к хроническому вирусному гепатиту, могут свидетельствовать о завершении вирусной инфекции. АТ к preS₁^- – preS₂-фрагментам HВsAg. Свидетельствуют о развитии протективного иммунитета при завершении инфекционного процесса. АТ к Рre-S₁ выявляют одновременно с АТ к HВсAg, а АТ к Рre-S₂.

Лечение. Средства специфической терапии отсутствуют, лечение в основном симптоматическое. Определенные перспективы имеет применение ингибиторов ДНК-полимеразы (например, ламивудина), α-ИФН и его индукторов. Несмотря на то что на терапию ИФН реагируют менее 50% пациентов, показаны достоверное исчезновение всех маркеров инфекции (ДНК вируса гепатита В, HВsAg и HВеAg) и увеличение титров АТ к HВsAg.

Иммунопрофилактика. Пассивная иммунизация специфическим Ig (HВIg) показана лицам, контактировавшим с инфицированным материалом и носителями HВsAg (включая половых партнеров и детей, родившихся от HВsAg-положительных матерей). Для активной иммунизации разработаны два типа вакцин. Первые готовят из плазмы пациентов, содержащей Ar. Вируса гепатита В в количествах, достаточных для создания вакцинных препаратов. Главное условие – полная инактивация вируса гепатита В. Вторую группу составляют рекомбинантные вакцины (например, Recombivax B, Engerix B), полученные методом генной инженерии на культурах пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Массовая иммунизация – важнейший компонент борьбы с инфекцией. Взрослые получают 2 дозы в течение месяца и бустерную иммунизацию через 6 месяцев. Дети получают первую дозу сразу после рождения, следующие – через 1-2 месяца и к концу первого года жизни. Если мать HВsAg-положительна, то ребенку вводят специфический Ig одномоментно с первой вакцинацией.

ВИРУС ГЕПАТИТА D (ГЕПАТИТ ДЕЛЬТА)

Вирус гепатита D обнаружил М. Ризетто и сотр. (1977) в ядрах гепатоцитов во время необычно тяжелой вспышки сывороточного гепатита в Южной Европе. Позднее его стали обнаруживать повсеместно, особенно часто в Северной Америке и странах Северо-Западной Европы.

Таксономия, морфология, антигенная структура. Возбудитель дельта-гепатита – дефектный РНК-содержащий вирус рода Deltavirus семейства Togaviridae. Его выделяют только от пациентов, инфицированных вирусом гепатита В. Дефектность возбудителя проявляется в полной зависимости от его передачи, репродукции и наличия вируса гепатита В. Соответственно, моноинфекция вирусом гепатита D абсолютно невозможна. Вирионы вируса гепатита D имеют сферическую форму, 35-37нм в диаметре. Геном вируса образует однонитевая кольцевая молекула РНК, что сближает вирус гепатита D с вироидами. Ее последовательности не имеют гомологии с ДНК возбудителя гепатита В, но суперкапсид вируса D включает значительное количество HВsAg вируса гепатита В. Резервуар возбудителя – инфицированный человек; вирус передается парентеральным путем. Возможна вертикальная передача вируса гепатита D от матери к плоду.

Патогенез и клинические проявления. Инфицирование HВsAg-положительных лиц сопровождается активным размножением вируса гепатита D в печени и развитием хронического гепатита – прогрессирующего или фульминантного. Клинически проявляется только у лиц, инфицированных вирусом гепатита В. Может протекать в двух вариантах:

Коинфекция (одновременное заражение вирусами гепатитов В и D). Отмечают короткий продромальный период с высокой лихородкой;

• часто мигрирующие боли в крупных суставах;
• нарастание интоксикации в желтушном периоде;
• часто болевой синдром (боль в проекции печени или эпигастрии);
• возникновение через 2-3 недели от начала заболевания или клинико-лабораторного обострения. Течение относительно доброкачественное, но восстановительный период протекает длительное время.

Суперинфекция заражение вирусом гепатита D человека, инфицированного вирусом гепатита В). Отмечают короткие инкубационный и преджелтушный периоды (3-5 дней) с высокой лихорадкой, выраженной интоксикацией, повторной рвотой, болевым синдромом, артралгиями. Характерны выраженная желтуха, развитие отечно-асцитического синдрома, выраженная гепатоспленомегалия, повторные клинико-лабораторные обострения. При данном варианте возможно развитие злокачественной (фульминантной) формы заболевания с летальным исходом.

Принципы микробиологической диагностики. Для диагностики острых и хронических вирусных гепатитов D широко применяют ИФА и РИА Маркеры репликации вируса – АТ (IgМ) к Ar вируса гепатита D и вирусная РНК. Ar вируса гепатита D появляется в крови через 3 недели после инфицирования. Вирусспецифические IgМ появляются через 10-15 дней после развития клинических проявлений. Через 2-11 недель можно идентифицировать вирусспецифические IgG, постоянно циркулирующие у инфицированных лиц.

Лечение и профилактика. Средства специфической химиотерапии и иммунопрофилактики отсутствуют. Поскольку репродукция вируса гепатита D невозможна в отсутствие возбудителя гепатита В, то основные профилактические мероприятия должны быть направлены на предупреждение развития гепатита В.

ВИРУС ГЕПАТИТА С

Гепатит С обычно протекает хронически и характеризуется преимущественным развитием хронических форм гепатита с исходом в цирроз и первичную карциному печени.

Таксономия, морфология, антигенная структура. Вирус гепатита С включен в состав рода семейства Flaviviridae. Вирионы сферической формы диаметром 35-50 нм окружены суперкапсидом. Геном образует однонитевая – РНК. Выделяют 6 сероваров, каждый из которых «привязан» к определенным странам. Например, в США распространен вирус гепатита С 1-го типа, в Японии – 2-го.

Патогенез и клиническая картина. Резервуар возбудителя – инфицированный человек. Основной путь передачи вируса – парентеральный. Основное отличие от эпидемиологии вируса гепатита В – более низкая способность вируса гепатита С к передаче от беременной к плоду и при половых контактах. Больной выделяет вирус за несколько недель до появления клинических признаков и в течение 10 недель после начала проявлений. Заболевание чаще регистрируют в США (до 90% всех трансфузионных гепатитов) и Африке (до 25%). Для клинической симптоматики вирусного гепатита С характерны изменение консистенции и размеров печени. При активном процессе печень обычно увеличена и болезнена при пальпации, ее консистенция умеренно плотная. Другие проявления включают спленомегалию, диспепсический и астенический синдромы, желтуху, артралгии и миалгии, кардиты, васкулиты, легочные поражения, анемии и др. Осложнения хронического процесса – цирроз и первичная карциома печени.

Принципы микробиологической диагностики. Маркеры репликации вируса – АТ (IgМ) к Ar вируса гепатита С РНК. Маркеры выявляют методами ИФА и ПЦР. Показание для поиска АТ или РНК вируса – любое воспалительное заболевание печени. Вирусспецифические АТ появляются в среднем через 3 месяца и указывают на возможное инфицирование вирусом гепатита С или на перенесенную инфекцию. В серонегативный период выявляют РНК вируса гепатита С. Для подтверждения результатов ИФА, а также при обследовании пациентов, не относящихся к основным группам риска, применяют метод рекомбинантного иммуноблотинга, позволяющий эффективно исключить ложноположительные результаты ИФА.

Лечение и профилактика. Средства этиотропной терапии отсутствуют; при хронических инфекциях можно использовать α-ИФН. На фоне терапии ИФН у 40-70% больных отмечают стихание воспалительного процесса (на что указывает снижение содержания концентрации аминотрансфераз в сыворотке), однако по окончании курса у 40-50% пациентов наблюдают рецидив воспаления. Средства специфической иммунопрофилактики не разработаны.

ВИРУС ГЕПАТИТА Е

Гепатит Е – острое инфекционное поражение печени, проявляющееся симптомами интоксикации и, реже, желтухой.

Патогенез и клиническая картина. Вирус гепатита Е включен в род Calicivirus семейства Caliciviridae. Вирионы сферической формы 27-38 нм в диаметре. Геном образован несегментированной молекулой +РНК.

Патогенез и клиническая картина. Резервуар возбудителя – человек. Эпидемиология заболевания во многом аналогична гепатиту А; возбудитель вызывает эндемичные вспышки. Инкубационный период не превышает 2-6 недель. Заболевание проявляется общим недомоганием; желтуху наблюдают сравниетльно редко. В большинстве случаев прогноз заболевания благоприятный, и пациенты полностью выздоравливают. Инфицирование беременных, особенно в ІІІ триместре, может закончиться фатально (смертность может достигать 20%). Хронизации процесса не наблюдают. Выздоровление сопровождается формированием стойкой невосприимчивости к повторным заражениям.

Принципы микробиологической диагностики. Маркеры репликации вируса – АТ (IgМ) к Ar вируса гепатита Е и вирусная РНК. Вирус-специфические IgМ выявляют методом ИФА, начиная с 10-12 суток после инфицирования; диагностические титры сохраняются в течение 1-2 месяцев. АТ класса IgG к Ar вируса гепатита Е появляются через месяц после перенесенного заболевания. РНК вируса выявляют в реакциях ПЦР и молекулярной гибридизации РНК вируса можно выявлять с первых суток инфицирования; однако в желтушном периоде обнаружить ее невозможно.

Лечение. Средства этиотропной терапии и специфической профилактики отсутствуют; проводят симптоматическое лечение.

ВИРУС ГЕПАТИТА G

Таксономия, морфология, антигенная структура. Таксономическое положение вируса G остается невыясненным. Его условно относят к семейству Flaviviridae. Геном образован несегментированной молекулой +РНК. Нуклеокапсид организован по типу кубической симметрии. По набору Ar вирионов высказывают предположение о наличии, как минимум, трех подтипов вируса. Предположительно, вирус гепатита G является дефектным вирусом, и для его репродукции необходимо присутствие вируса гепатита С.

Патогенез и клиническая картина. Резервуар возбудителя – больные острым или хроническим гепатитом G и носители вируса гепатита G. Часто регистрации заболевания сравнительно невелика. В РФ частота выявления РНК вируса гепатита G колеблется от 2% в Москве до 8% в Якутии. В то же время в сыворотке крови доноров частота выявления РНК вируса гепатита G составила 1,4%. Чаще маркеры инфицирования вирусом гепатита G выявляют у лиц, получающих множественные переливания цельной крови или ее препараты, а также среди пациентов с трансплантатами. Особую группу риска составляют наркоманы (среди лиц, вводящих наркотики внутривенно), частота выявления РНК вируса гепатита G достигает 33-35%). Нарушения иммунного статуса способствует развитию длительного носительства вируса. Доказана возможность вертикального пути передачи вируса гепатита G от инфицированной матери к плоду. Гепатит G в большинстве случаев протекает как микст-инфекция с вирусным гепатитом С, существенно не влияя на характер развития основного процесса.

Принципы микробиологической диагностики. Маркеры репликации вируса - АТ(IgМ) к Ar вируса гепатита G и вирусная РНК. Вирус-специфические IgМ выявляют методом ИФА, начиная с 10-12 суток после инфицирования; диагностические титры сохраняются в течение 1-2 месяцев. АТ класса IgG к Ar вируса гепатита Е появляются через месяц после перенесенного заболевания. РНК вируса выявляют в реакциях ПЦР и молекулярной гибридизации. РНК вируса можно выявлять с первых суток инфицирования; однако в желтушном периоде обнаружить ее невозможно.