Методика проведения занятия и методические указания по теме.
Тема 16. Титрование вирусов
Контрольные вопросы
Задание к следующему занятию.
Подведение итогов занятия.
Задание
Определить наличие в сыворотке крови кролика антител к вирусу ньюкаслской болезни.
Самостоятельная работа: а) залив агара на предметные стекла; б) изготовление лунок в слое агара; в) разлив компонентов РДП; г) снаряжение влажной камеры; д) зарисовка схемы РДП в тетрадях; е) учет результатов РДП и их внесение в схему РДП производятся на следующий день или на следующем занятии.
1. В чем принцип РДП?
2. Какие задачи позволяет решать РДП?
3. В чем достоинства и недостатки РДП?
Цель занятия: ознакомление с методикой титрования вирусов
Оборудование и материалы: задачи на определение титра вируса в ЭД50 по фактическим данным, выписанные на карточки (на каждого студента по одной карточке, всего не менее 10 вариантов задач); аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни; 1%-ная суспензия отмытых эритроцитов кур; физиологический раствор (изотонический раствор NaCl); плексигласовые панели с лунками; градуированные пипетки на 1 мл; резиновые груши; сосуды с дезраствором; карандаши для записи по стеклу, калькуляторы, логарифмические таблицы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
|
|
В лабораторных работах с вирусами, биофабричном производстве и в ветеринарной практике постоянно возникает необходимость определения количества вирусов в том или ином материале. Без такого определения невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство живых и инактивированных противовирусных вакцин и диагностических препаратов, оценка активности живых противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и многие другие работы.
Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале.
Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.
Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.
|
|
Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ — одной оспины.
Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.
Таблица 6.
Виды единиц количества вирусов при определении по 50%-ному инфекционному действию
Тест-объекты | Виды инфекционного действия вирусов | Единицы количества вирусов | ||
названия единиц | сокращение обозначения | |||
Лабораторные | Гибель | 50%-ная летальная | ЛД50 | |
животные | доза | |||
То же | Клинические симп- | 50%-ная инфекци- | ИД50 | |
томы или патоло- | онная доза | |||
гоанатомические | ||||
изменения | ||||
Куриные эмбри- | Гибель | 50%-ная эмбриональ- | элд50 | |
оны | ная летальная | |||
доза | ||||
То же | Патологоанатоми- | 50%-ная эмбриональ- | эид50 | |
ческие изменения | ная инфекционная | |||
доза | ||||
Культуры клеток | Цитопатический | 50%-ная цитопати- | ЦПД50 | |
эффект | ческая доза | |||
В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.
Иначе говоря:
1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);
1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;
1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;
1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;
1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).
Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.
Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.
|
|
Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.
Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.
Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:
во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД50, на значительном отрезке приближается к прямой.
Рисунок 35. График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса
Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД50, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;
во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.
Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).
|
|
После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД50. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД50) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД50. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.