Требования, предъявляемые к питательным средам

Готовые питательные среды должны:

1. Удовлетворять потребностям обмена веществ микробной клетки;

2. Легко усваиваться бактериями;

3. Содержать необходимые соли (NaCl, K, Mg, Ca);

4. Быть стерильными;

5. Иметь оптимальную рН;

6. Иметь достаточную влажность (плотная среда должна иметь не меньше 60% влаги);

7. Содержать факторы роста.

По составу питательные среды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические.

Естественные среды состоят из натуральных продуктов животного или растительного происхождения. Основой таких сред являются молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются все компоненты для их роста и размножения.

Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь большой набор компонентов, но могут быть и простыми по составу. Эти среды удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращения в соответствующие продукты обмена.

По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие.

Жидкие среды применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов. Примером наиболее часто применяемой жидкой питательной среды является мясо-пептонный бульон (МПБ).

Для его приготовления сначала готовят мясной отвар. С этой целью свежее мясо (говядину, телятину) освобождают от костей и сухожилий, пропускают через мясорубку. 500 г такого фарша заливают 1 л водопроводной воды и оставляют на 24 часа для экстрагирования необходимых для питания микроорганизмов веществ. Затем мясо отжимают через марлю и полученный настой кипятят в течение 30 минут для свёртывания белка, который отделяют фильтрованием.

Отфильтрованный настой стерилизуют. Стерильная мясная вода является основой для приготовления мясо-пептонного бульона. Для этого к 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона и 5 г NaCl. Пептоны добавляют взамен свернувшегося белка. Они являются продуктами неполного разрушения белка, получаемыми кислотным или ферментативным гидролизом мяса или молочного казеина. Преимуществом этих источников аминокислот является то, что они легко усваиваются и при стерилизации не свёртываются. Поэтому стерильный бульон остаётся прозрачным.

Рост микроорганизмов в таких средах легко отмечается визуально по появлению мутности. МПБ – богатая питательная среда, но в ней мало углеводов.

Плотные среды необходимы для выделения и изучения свойств чистых культур микроорганизмов, так как на них можно получить изолированный рост отдельных клеток. Плотные питательные среды (мясо-пептонный агар (МПА)) готовят из жидких посредством добавления к ним агар-агара. Агар-агар (по малайски – желе) получают из водорослей. Это сложный полисахарид, который образует гель с точкой плавления 96 – 100 ºС и температурой застывания 40 ºС. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать.

Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1-2% агар-агара. Среду с внесённым в неё агаром нагревают на водяной бане до расплавления последнего. Полученный горячий раствор фильтруют через гигроскопическую вату и разливают по чашкам Петри и пробиркам.

Сухие питательные среды изготовляются в виде сухих порошков, которые хорошо растворяются в воде при комнатной температуре. Преимущество таких сред в их стандартности, стабильности, простоте приготовления и удобстве при транспортировке. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, хранящиеся в специальных флаконах. В лаборатории из порошков готовят соответствующие питательные среды по прописи указанной на этикетке. Чаще всего применяют сухой питательный агар, среду Эндо.

По назначению среды подразделяются на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Обычные (простые) среды используют для культивирования большинства микроорганизмов. Это мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).

Специальные среды – это среды, предназначенные для выявления тех или иных микроорганизмов или получения культуры микроорганизмов, обладающих особыми свойствами.

Среди специальных сред различают:

1. Элективные (избирательные)

2. Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.

Элективные среды (от латинского слова electus – избираю) подобраны таким образом, чтобы обеспечить оптимальные условия для выращивания определённых микроорганизмов. В них могут быть добавлены вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. При посеве материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего проявляется рост того вида, для которого данная среда будет избирательно пригодна.

Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их задерживается. Такие среды применяют для выделения микробов определённых видов из объектов, содержащих постороннюю микрофлору.

Например, холерный вибрион может развиваться в присутствии относительно высокой концентрации щелочи(1%), губительно действующей на сопутствующую. Дифтерийная палочка опережает по быстроте роста на свёрнутой кровяной сыворотке Лёффлера сопутствующую микрофлору зева.

Дифференциально-диагностическине среды применяются для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов (нейтральный красный, феноловый красный, метиленовый синий). Изменяя окраску при различных значениях РН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата.

Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы. В состав этой среды входит МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который Взаимодействует с сульфитом и окрашивает колонии кишечной палочки в красный с металлическим блеском цвет.

Таким образом, на среде Эндо легко отличить кишечную палочку от брюшно-тифозных и дизентерийных микроорганизмов, которые дают бесцветные колонии, так как не сбраживают лактозу. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свёрнутого яичного или сывороточного белка.

По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своём составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.д..

2. Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.

3. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

4. Среды для определения редуцирующей способности микробов.

Засеянные среды выдерживают в условиях, обеспечивающих жизнедеятель­ность микроорганизмов. К таким условиям относится температурный режим, влаж­ность, аэрация, свет и другие специфические факторы.

Температура. Оптимальную для микроорганизмов температуру обеспечивают в специальных шкафах-термостатах. Термостат-прибор, в котором с помощью тер­морегуляторов поддерживается постоянная температура. За температурой в термостате следят по показаниям термометра. Используют термостат для выращивания микроорганизмов на питательных средах при оптимальной температуре. Для большинства патогенных микроорганизмов оптимальной температурой роста является температура +37 °С.

Влажность. Культивирование микроорганизмов возможно только во влажных условиях. Для бактерий необходимо капельно-жидкая вода, так как питательные вещества проникают в клетку только в растворенном состоянии. Минимальное содержание свободной воды, при котором возможно развитие, для большинства бактерий равно 20%. При культивировании в жидких средах проблема поддерживания влажности отпадает. Плотные агаризованные среды всегда содержат некоторое количество капельно-жидкой воды. Она бывает заметна в виде конденсата на стенках пробирок. Однако при длительном хранении культур на плотных средах при комнатной темпе­ратуре, и даже в холодильнике, среды подсыхают,что может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому необходимо производить регулярные своевременные пересевы культур, не допуская подсыхания сред.

Свет. Подавляющему большинству микроорганизмов свет не нужен. Прямые солнечные лучи отрицательно влияют на развитие многих микроорганизмов. В ла­бораторных условиях микроорганизмы культивируют в неосвещенных термостатах. Микроорганизмы, использующие в процессе обмена веществ энергию света, выра­щиваются при освещении. Для освещения обычно применяют лампы накаливания мощностью 75-100 Вт.